一株養(yǎng)殖沙塘鱧腸道溶血性蘇云金芽孢桿菌的分離鑒定

趙彥華，史楊白，劉國興，薛暉

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）是一種革蘭氏陽性桿菌，屬微生物源殺蟲劑，以胃毒作用為主[1]。其中蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis, Bti）是一種對蚊幼蟲具有毒殺作用的病原微生物，主要作用成分是芽孢形成過程中合成的具有特異殺蟲活性的毒素蛋白[2]。它同蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、人畜病原菌炭疽芽孢桿菌（B.anthracis）、蕈狀芽孢桿菌（B.mycoides）、韋氏芽孢桿菌（B.weihenstephanensis）組成芽孢桿菌屬蠟狀芽孢桿菌組（B.cereus group），它們的形態(tài)特征、生理生化特征非常相似，并有著極高的DNA 同源性[3]。

在沙塘鱧養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展過程中，養(yǎng)殖環(huán)境中大量細菌的分布及沙塘鱧種質(zhì)資源的退化，導(dǎo)致沙塘鱧的病害日趨嚴重。近年來，在沙塘鱧養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)如鰓部及頭部潰爛，腸道出血，體表有出血點等病害現(xiàn)象，但目前針對養(yǎng)殖沙塘鱧病害的研究及防控均處于初級階段，針對養(yǎng)殖過程中的病害死亡原因，無統(tǒng)一定論?，F(xiàn)對養(yǎng)殖沙塘鱧內(nèi)臟細菌進行分離，在腸道內(nèi)獲得一株溶血性蘇云金芽孢桿菌，并進行一系列研究，以期為沙塘鱧養(yǎng)殖病害提供防治參考。

1 研究方法

1.1 材料

沙塘鱧取自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所沙塘鱧養(yǎng)殖基地，魚體大小約8～11 cm，體質(zhì)量約為25～30 g。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 取沙塘鱧，用75%酒精消毒體表后，按照無菌操作的方法，用滅菌手術(shù)剪剪開其頭部及腹部，分別取肝臟及腸道，勻漿后接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上。28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h 后，挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢菌，編號為SCYB2019 并進行分離純化、保種。

1.2.2 分離菌鑒定 選取典型菌落，分離純化后進行常規(guī)生理生化特征檢驗，檢驗參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]進行常規(guī)生化指標鑒定。生理生化指標采用API/ATB 半自動化細菌分析儀鑒定，將分離純化的菌落混于生理鹽水中，濃度為0.5 mol/L McFarland。吸取菌懸液接種ID32E 測試卡，每孔接種55 μL，置于35 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。取出置于分析儀閱讀器上檢測反應(yīng)，得出編碼，轉(zhuǎn)化判定結(jié)果。

1.2.3 溶血性試驗 將菌株SCYB2019 接種于4%綿羊血平板，綿羊血平板購自環(huán)凱生物科技有限公司，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后觀察其溶血性。

1.2.4 細菌16 S rDNA 的鑒定 將分離純化后菌株SCYB2019，用細菌通用引物擴增于上海生工有限公司測定細菌的16 S rDNA 序列，將所得菌株16 S rDNA 序列輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，同時從GenBank 中下載芽孢桿菌屬多個序列，利用MEGA4.1 軟件包進行序列比對，并采用鄰接法（Neighbor-Joining method）分析同源性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌菌落特征

沙塘鱧肝臟勻漿后涂布的培養(yǎng)基中未見有細菌長出，而在腸道涂布的普通營養(yǎng)瓊脂平板中可見大量形態(tài)特征均一致的圓形菌落，菌落邊緣呈鋸齒狀，表面粗糙呈白蠟狀，經(jīng)革蘭氏染色，在顯微鏡的油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，革蘭氏染色陽性，細菌呈桿狀，紫色，以短鏈或長鏈分布，無莢膜，具運動性（圖1）。

圖1 SCYB2019 菌落特征及革蘭氏染色

2.2 分離菌的生理生化特征

生理生化特征經(jīng)API/ATB 半自動化細菌分析儀鑒定，表明菌株SCYB2019 隸屬于芽孢桿菌屬Bacillus sp.（表1）。

2.3 分離菌溶血性分析

在綿羊血平板上，菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，見圖2。

表1 SCYB2019 生理生化特征①

圖2 SCYB2019 溶血活性

2.4 細菌的16 S rDNA 序列分析

菌株SCYB2019 的16 S rDNA 大小為1 480 bp，輸入GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果顯示與蘇云金芽孢桿菌序列具有100%的覆蓋率和100%的同一性。采用鄰接法構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可見，從發(fā)育樹中可以看出SCYB2019 與蘇云金芽孢桿菌同源性達到90%以上，同時結(jié)合生理生化特征，鑒定菌株SCYB2019 為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），

3 討論

圖3 以16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

沙塘鱧屬魚類分布于中國境內(nèi)共有4 種，即河川沙塘鱧、鴨綠沙塘鱧、海豐沙塘鱧（O.haifengensis）、中華沙塘鱧（O.sinensis）[5]。沙塘鱧（Odontobutis obscurus）又名河川沙塘鱧，還有烏草包、土布魚等稱謂，是鱸形目、塘鱧科、沙塘鱧屬的魚類，一般分布在我國長江水系中下游、閩江等水系中[6]。因其刺少肉多，肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)豐富，所含人體必需的氨基酸比一般魚類高等特點，故在江浙地區(qū)廣受歡迎。河川沙塘鱧分布較廣且自然資源量豐富，但個體較小，繁育周期長且不易被馴化吃飼料[7]。近些年，隨著野生資源的急劇衰退和市場需求的不斷增長，河川沙塘鱧已發(fā)展成為一個非常具有潛力的水產(chǎn)養(yǎng)殖新品種[8]。目前全國已經(jīng)零星開展了沙塘鱧的混養(yǎng)和套養(yǎng)，但產(chǎn)量還遠不能滿足市場的消費需求[9]。

近年來，蠟狀芽孢桿菌被認為是一種有益的微生物，開始用作益生素添加到食品和飼料中，部分菌株還作為植物生長促進劑使用[10]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，也廣泛開始使用蠟狀芽孢桿菌制劑，不僅僅可以改善養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化，其代謝產(chǎn)物能夠抑制病原菌和有害藻類生長，而蘇云金芽孢桿菌與蠟狀芽孢桿菌的區(qū)別在于蘇云金芽孢桿菌攜帶殺蟲質(zhì)粒，能夠編碼形成芽孢孢外膜外的伴胞晶體，這使得蠟狀芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌之間可相互轉(zhuǎn)化[11]。目前，有學(xué)者鑒于蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌基因組的高度同源性，認為蘇云金芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌應(yīng)歸為同一個種[12]，該次試驗通過傳統(tǒng)的16 S rDNA 分析，得到了分離到的細菌為蘇云金芽孢桿菌的結(jié)論。

在養(yǎng)殖沙塘鱧腸道內(nèi)的蘇云金芽孢桿菌，極有可能是在使用含有蠟狀芽孢桿菌的微生物制劑的過程中，蠟狀芽孢桿菌轉(zhuǎn)化為蘇云金芽孢桿菌，而蘇云金芽孢桿菌本身就攜帶腸毒素基因，能夠造成養(yǎng)殖品種的病害。李丹蕾等[13]的研究表明，蘇云金芽孢桿菌能夠造成健康凡納濱對蝦死亡，并且表現(xiàn)出肝胰腺壞死的癥狀。這就要求在養(yǎng)殖過程中應(yīng)用含有蠟狀芽孢桿菌的微生態(tài)制劑時，有必要對這些菌株安全性進行系統(tǒng)的分析和評價。