溫度對斑玉蕈菌絲共生細菌多樣性和群落結構的影響*

柳 婷，許 欣，孔旭強，陳利丁，黃 勝，陳劍秋，孫淑靜

（福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002）

斑玉蕈 [Hypsizygus marmoreus（Peck） H.E.Bigelow]，屬于擔子菌門 （Basidiomycota） 傘菌綱（Hymenomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 玉蕈屬 （Hypsizygus）[1-2]，又名玉蕈，俗稱真姬菇、海鮮菇，其子實體形態(tài)優(yōu)美、口感飽滿，富含蛋白質、氨基酸和維生素，能有效清除體內自由基，提高機體免疫力，預防衰老[3]，是近年來食用菌市場深受歡迎的品種之一。

溫度作為斑玉蕈生長發(fā)育的重要環(huán)境因素，溫度的高低直接影響菌絲的生長、出菇時間以及子實體品質等。林小花等[4]的研究表明斑玉蕈在菌絲生長階段溫度需控制在22℃～25℃，低溫時菌絲生長緩慢，高溫下易受雜菌污染。胡開輝等[5]研究了外界因子對蟹味菇（Hypsizygus marmoreus） 菌絲特性的影響。發(fā)現溫度對蟹味菇菌絲和子實體生長有顯著影響。適宜的出菇溫度下子實體原基形成快、整齊度好、大小均勻且質地結實，出菇溫度高時原基形成及子實體成熟時間延長，出菇整齊度差且質地較軟。目前溫度影響菌絲生長及其出菇機理尚不明確。

細菌與許多真核生物均存在重要共生關系，是其物質轉化、信息傳遞的重要參與者。細菌群落結構組成和多樣性是反映真核生物營養(yǎng)利用、生長發(fā)育的重要指標。高度多樣性細菌的群落能在一定程度上應對環(huán)境條件的變化，以改變群體的結構來適應新環(huán)境。張俊蘭[6]采用研磨法從6種食用菌子實體中分離到內生菌58株；劉燦[7]研究發(fā)現在雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）子實體中存在內生菌并分離到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilus）。此外，許多研究表明細菌對食用菌菌絲生長有一定作用。楊民和[8]發(fā)現食用菌與有益微生物的相互作用可為食用菌提供了更適的條件，在雙孢蘑菇栽培床表面覆土可有效促進其從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉化。董曉雅等[9]、張繼英等[10]發(fā)現熒光假單孢菌（Pseudomonas fluorescens） 對平菇 （Pleurotus ostreatus）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）和雙孢蘑菇的菌絲生長和出菇均有較強的促進作用。因此探究溫度對食用菌共生細菌多樣性的影響及群落結構的變化規(guī)律，及闡明溫度對食用菌菌絲生長和出菇作用機理及其調控具有重要的理論意義。研究利用高通量測序技術分析溫度對斑玉蕈菌絲共生細菌多樣性和群落結構的影響，為進一步探索溫度影響斑玉蕈菌絲生長、形態(tài)建成的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種

供試菌株斑玉蕈（閩真2號），為本實驗室保藏菌種。

1.1.2 主要試劑

E-MF21馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，日本榮研公司，稱取3.9 g粉末加100 mL去離子水，121℃滅菌20 min備用。

EasyPure Genomic DNA Kit提取試劑盒、PCR相關試劑、AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長速度測定及形態(tài)觀察

無菌條件下將活化后的菌種塊（直徑=1.0 cm）分別接種于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、37℃下培養(yǎng)18 d，每組10個重復，從第4天開始每隔4 d測其菌絲生長速度，并觀察其形態(tài)特征。其菌絲生長速度（V，cm·d-1）公式為：

式中：S為菌絲生長直徑（cm）；D為菌絲生長天數（d）。

1.2.2 16S rRNA高通量測序

采用EasyPure Genomic DNA Kit提取試劑盒提取15個樣品總DNA，PCR擴增，選擇細菌特異引物 338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和 806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，對 16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)片段進行PCR擴增，PCR程序如下：98℃預變性2 min；98℃變性30 s；50℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸5 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收，運用Illumina HiSeq 2500測序平臺送北京百邁克生物科技有限公司進行高通量測序。

1.2.3 數據分析

通過FLASH軟件對原始數據進行拼接[11]，采用Trimmomatic軟件將拼接得到的序列進行質量過濾[12]，并用UCHIME軟件去除嵌合體[13]，得到高質量的序列（Tags）。通過USEARCH軟件在相似性97%水平上對序列進行聚類[14]，以測序所有序列數的0.005%作為閾值過濾操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），將OTU的代表序列與微生物參考數據庫細菌16S：Sliva（http://www.arb-silva.de） 進行比對可得到每個OTU對應的物種分類信息，進而在門、綱、目、科、屬、種層面統(tǒng)計各樣品的群落組成。

運用Mothur軟件分析OTU豐度及Alpha指數[15]，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息。在97%一致性閾值下，ACE指數值越大表明該群落中物種種類越多，Chao1指數可以估計群落中的OTU數目，其值越高表明群落物種數目越豐富，細菌多樣性包括種類的多少和每個種類分布的均勻度；香農指數（Shannon） 和辛普森指數（Simpson） 可以反應細菌多樣性，其中Shannon指數受到種類多少的影響較大，Simpson指數受到種類分布均勻度的影響較大。

1.2.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS對斑玉蕈菌絲生長速度進行單因素方差分析。用species-sample豐度數據對斑玉蕈菌絲共生細菌菌群矩陣做除趨勢對應分析（DCA），發(fā)現最大梯度長度（lengths of gradient）小于3.0，采用冗余分析（RDA）探討斑玉蕈菌絲共生細菌群落結構和溫度之間關系。

2 結果

2.1 不同溫度對菌絲生長速度及形態(tài)特征的影響

不同溫度對斑玉蕈菌絲生長速度及形態(tài)特征的影響見表1及圖1。

表1 菌絲生長速度及形態(tài)特征Tab.1 Mycelial growth rate and characterization

圖1 不同溫度下菌絲形態(tài)特征Fig.1 Mycelial characteristics at different temperatures

由表1和圖1可看出，菌絲在20℃培養(yǎng)時生長速度最快，其次是25℃，菌絲潔白、濃密，氣生菌絲強、邊緣圓滑規(guī)則，但25℃菌絲濃密度與緊實度比20℃強；菌種在28℃培養(yǎng)時生長速度慢，菌絲潔白度較高，但濃密度較低，氣生菌絲弱，在15℃培養(yǎng)時生長速度較慢，在30℃培養(yǎng)時生長速度最慢，菌絲發(fā)黃，濃密度最低，氣生菌絲最弱，邊緣角變不規(guī)則，37℃培養(yǎng)時菌絲停止生長。菌種在不同溫度下生長速度差異顯著，適宜溫度能提高菌絲生長速度和規(guī)則菌絲形態(tài)形成，高溫顯著抑制菌絲生長與形態(tài)形成。

2.2 測序結果及序列深度驗證

不同溫度下樣品的有效序列數、OTU數和覆蓋率的統(tǒng)計見表2。

表2 不同溫度下樣品的有效序列數、OTU數和覆蓋率Tab.2 Effective sequence number,OTU number and coverage of samples at different temperatures

表2對5個溫度下的15個樣品進行了16S rRNA基因高通量測序，經序列過濾和去除嵌合體序列，各樣品有效序列數量從60 591條～67 643條不等，平均為63 684條，5組樣品平均序列長度453 bp～550 bp。

由圖2所示，樣品稀釋曲線趨向平坦，由表2可知，5組樣品的細菌覆蓋率99.92%～99.95%，說明取樣合理，測序結果較真實地反映了不同溫度下菌絲共生細菌的群落組成，置信度高。

圖2 不同溫度97%相似性的OTU稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of OTUs clustered at 97% sequence across different temperatures

2.3 細菌多樣性分析

在相似度97%情況下，不同溫度下樣品細菌多樣性統(tǒng)計分析見表3。

表3 不同溫度下樣品細菌多樣性統(tǒng)計分析Tab.3 Analysis of bacterial diversity at different temperatures

由表3知，ACE指數15℃最高，30℃次之，均遠高于其他溫度，表明這2個溫度下菌絲細菌群落中物種數目較多，Chao 1值30℃最高，同時OTU數30℃最大，表明30℃時物種豐富度最高。Shannon指數15℃最高，30℃次之，表明這2個溫度下細菌種類較多，Simpson指數25℃最高，15℃最低，30℃偏低，表明25℃時細菌種類分布最均勻，而15℃和30℃細菌分布相對不均勻。

2.4 細菌群落組成分析

基于USEARCH軟件的聚類結果，將OTU在各個分類水平上進行分析，獲得樣品在門、綱、目、科、屬、種分類學水平上的群落結構，所有樣品共檢測到細菌35門、86綱、196目、350科、685屬，本文選取豐度較高的10個門及屬的細菌，分析溫度變化對其影響，繪制細菌群落組成條形圖見圖3。

圖3 不同溫度下門和屬的細菌群落組成Fig.3 Bacterial community composition of phylum and genus at different temperatures

由圖3a可知，在門水平豐度柱狀圖中，變形菌門 （Proteobacteria） 24.10%～35.80%，厚壁菌門（Firmicutes） 19.36%～25.43%，擬桿菌門 （Bacteroidetes） 13.07%～19.35%，放線菌門 （Actinobacteria） 9.34%～13.64%，藍細菌門 （Cyanobacteria）2.97%～24.17%，梭桿菌門 （Fusobacteria） 1.52%～3.10%，疣微菌門 （Verrucomicrobiae） 1.38%～2.87%，綠彎菌門（Chloroflexi）0.53%～2.51%，酸桿菌門 （Acidobacteria） 0.42%～1.60%，軟壁菌門（Tenericutes） 0.57%～1.41%，其他 （others） 2.30%～4.77%，以上菌門中變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門在各溫度下的豐度均高于10%為優(yōu)勢菌門。變形菌門在28℃下豐度最高，厚壁菌門在15℃豐度最高，擬桿菌門在20℃豐度最高。藍細菌門豐度在25℃（24.17%） 和 20℃（6.43%） 明顯高于其他溫度（2.96%～3.31%）。25℃細菌種類多屬于排名前10的門，其他豐度僅2.30%，15℃其他豐度為4.77%，20℃其他豐度為3.55%，28℃其他豐度5.91%，30℃其他豐度4.31%，不同溫度下其他類菌門的豐度差異較大。

由圖3b可知，基于屬水平分析，所有樣品共檢測到細菌685個屬，溫度對細菌屬水平豐度的影響主要涉及以下10個屬：擬桿菌屬 （Bacteroides）4.82%～10.24%，紅球菌屬 （Rhodococcus） 4.75%～6.93%，毛螺菌科 NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A 136_group） 1.14%～3.11%，普雷沃氏菌屬（Prevotella_9） 1.47%～2.47%，葡萄球菌屬（Staphylococcus） 1.27%～3.77%，蒼白桿菌屬 （Ochrobactrum） 0.54%～9.71%，克雷伯氏菌屬 （Klebsiella）0.34%～0.60%，甲基菌屬（Methylobacillus） 0.17%～5.93%，沙雷氏菌屬（Serratia） 0.002%～0.110%，其他（others） 72.43%～78.12%。其中紅球菌屬、葡萄球菌屬及毛螺菌科NK4A136組為革蘭氏陽性細菌，沙雷氏菌屬、擬桿菌屬、克雷伯氏菌屬、甲基菌屬、蒼白桿菌屬、普雷沃氏菌屬為革蘭氏陰性細菌。優(yōu)勢菌屬為擬桿菌屬、紅球菌屬、毛螺菌科NK4A136組，在各溫度下豐度均高于4%，擬桿菌屬豐度15℃為9.48%，20℃豐度10.24%，25℃豐度7.90%，28℃豐度4.82%，30℃豐度5.68%。該菌屬豐度在20℃和25℃顯著高于其他溫度；此外，甲基菌屬豐度在30℃ （5.93%）、28℃（2.44%） 高于 15℃ （0.18%）、20℃（0.17%）、25℃（0.36%），該菌屬豐度在20℃和25℃顯著低于其他溫度。

2.5 細菌群落結構差異分析

不同溫度下細菌群落結構差異中門水平細菌豐度聚類熱圖見圖4。

由圖4門水平細菌群落組成圖顯示，豐度高于10%的菌門較少，豐度較低的菌門較多，與門水平樣品細菌豐度聚類熱圖結果基本一致，不同溫度下優(yōu)勢菌門均較少。25℃培養(yǎng)時藍細菌門、變形菌門優(yōu)勢顯著，15℃疣微菌門、梭桿菌門豐度較高，20℃厚壁菌門、軟壁菌門豐度較高，28℃酸桿菌門、綠彎菌門豐度較高，30℃軟壁菌門、擬桿菌門豐度較高。不同溫度下細菌群落的豐度較高的菌門不完全相同。此外，圖4細菌群落結構關系顯示門水平25℃與30℃群落結構差異最大。屬水平細菌豐度聚類熱圖見圖5。

由圖5屬水平樣品細菌菌落聚類熱圖顯示，不同溫度下優(yōu)勢菌屬顯著不同，15℃葡萄球菌屬、紅球菌屬相對豐度顯著高于其他溫度，20℃擬桿菌屬相對豐度顯著高于其他溫度，25℃克雷伯氏菌屬相對豐度高于其他溫度，28℃蒼白桿菌屬相對豐度高于其他溫度，30℃瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、食酸菌屬（Acidovorax）、甲基菌屬、毛螺菌屬、甲基菌屬相對豐度高于其他溫度。各溫度群落結構相似度關系依次為30℃、15℃、28℃、20℃、25℃，屬水平20℃與25℃群落結構差異較小，與菌種表型特征結果相一致。

2.6 細菌群落結構與溫度的關系

優(yōu)勢菌屬與溫度的相關性分析見圖6。

由圖6可知，RDA的研究結果表明蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、甲基菌屬（Methylobacillus）、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A 136_group）、沙雷氏菌屬（Serratia） 菌屬豐度與溫度呈正相關，紅球菌屬（Rhodococcus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、葡萄球菌屬（Staphylococcus） 菌屬豐度與溫度呈負相關。

3 討論

3.1 溫度對細菌群落組成及結構的影響

溫度是影響細菌生長繁殖的重要因素，其變化會對細菌的種類和數量產生巨大影響。李云福等[16]通過高通量測序技術對雙孢蘑菇培養(yǎng)料發(fā)酵過程中細菌群落進行研究發(fā)現，堆肥前優(yōu)勢類群為變形菌門，一次發(fā)酵后優(yōu)勢類群為異常球菌-棲熱菌門、厚壁菌門等，二次發(fā)酵時綠彎菌門為主要類群。陳長卿等[17]對草菇（Volvariella volvacea） 栽培料二次發(fā)酵過程進行研究，發(fā)現發(fā)酵過程中溫度變化會改變栽培料中優(yōu)勢菌群及其細菌群落結構。本研究首次證實斑玉蕈菌絲共生細菌的存在，且溫度變化會對斑玉蕈菌絲中優(yōu)勢菌屬及其細菌群落結構產生重要影響，研究結果表明門水平下溫度變化會引起優(yōu)勢菌門的豐度增加。此外，25℃、20℃條件下藍細菌門豐度較高，15℃、20℃、30℃藍細菌豐度明顯降低，菌絲生長速度20℃和25℃顯著高于其他溫度，推測藍細菌門細菌與菌絲生長速度相關。屬水平結果表明不同溫度下擬桿菌屬、紅球菌屬，毛螺菌科NK4A136組的豐度均較高，25℃時最高，且25℃時菌絲長勢最佳，很可能是因為該類群豐度的升高可促進菌絲生長。當溫度高于25℃時，菌絲長勢較差，甲基菌屬豐度升高，推測甲基菌屬豐度與菌絲生長呈負相關。

3.2 溫度對細菌多樣性的影響

自然界中細菌種類繁多，不同細菌最適溫度的不同，使得不同環(huán)境中細菌多樣性及群落結構差異顯著，改變環(huán)境溫度會引起細菌多樣性變化。本研究中不同溫度下斑玉蕈菌絲細菌多樣性存在差異，25℃菌絲表型較優(yōu)，其菌群豐富度及種類多樣性較低但菌群種類分布最均勻，15℃菌絲生長速度較慢，其菌群豐富度及種類多樣性較高但分布最不均勻?？赡苁切庐a生的菌屬破環(huán)了原有菌群的均勻分布，不利于菌絲的生長，28℃和30℃菌絲的長勢較差，其菌群多樣性較高分布較均勻，可能是因為產生了抑制菌絲生長的雜菌。

3.3 菌絲生長速度及表型特征與共生細菌的關系

菌絲生長速度及表型特征與細菌群落多樣性、組成及結構有著密切的相關性，益生菌的存在、豐富度及豐度大小對菌絲生長至關重要。周巍巍[18]研究了惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida） 對雙孢蘑菇菌絲的促生作用及機理，發(fā)現惡臭假單胞菌可顯著提高雙孢蘑菇菌絲的生長速度及誘導并促進子實體的形成和發(fā)育。Cho等[19]從平菇菌絲表面分離得到的10種熒光假單胞菌菌株，其中7種在平菇原基形成和子實體發(fā)育的過程中具有促進作用。本研究中25℃時斑玉蕈菌絲生長速度較快、菌絲表型最佳，該溫度下擬桿菌屬、紅球菌屬及毛螺菌科NK4A136組為優(yōu)勢菌屬，表明這三類菌屬可能對斑玉蕈菌絲生長呈正面影響，30℃時菌絲生長速度最低且表型最差，該溫度下甲基菌屬豐度大幅高于其他溫度，表明這類菌屬可能對菌絲生長呈負面影響。

綜上所述，研究首次明確食用菌菌絲存在共生細菌，且細菌多樣性和群落結構與溫度相關性較大，同時表明共生細菌與菌絲生長、形態(tài)特征存在密切聯(lián)系，這為通過溫度調控食用菌生長發(fā)育機理以及共生微生物的開發(fā)利用提供了科學依據。