葡聚糖硫酸鈉自由飲用與灌胃誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的比較

茶亞飛，郭雪艷，李寶晶，李艷平，王 亭，毛曉健

(云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500)

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57 BL/6小鼠，♂，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2) g，購自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)方法及條件經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查合格，動(dòng)物倫理審查文件編號(hào)：R-06201934。

1.2 試劑0.9%氯化鈉注射液(昆明南疆制藥有限公司，批號(hào)C190521C)，DSS (3.6×104-5.0×104，MP Biomedicals公司，批號(hào)Q8378)，通用型組織固定液(武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)HJ194602)。

1.3 儀器萬分之一電子天平(BT 124S北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，超純水系統(tǒng)(Milli-Q Academic A10，美國(guó)Millipore公司)，超低溫冰箱(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模方式C57 BL/6雄性小鼠60只，隨機(jī)分為正常組、3% DSS溶液自由飲用組、4% DSS溶液自由飲用組、30% DSS溶液灌胃組、40% DSS溶液灌胃組，每組12只。實(shí)驗(yàn)從d 0開始造模，24 h后記為d 1，以此類推。灌胃組實(shí)驗(yàn)開始時(shí)間晚于自由飲用組1 d。30%灌胃組灌胃劑量與3%自由飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等；40%灌胃組灌胃劑量與4%自由飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等。每日用量筒測(cè)量并計(jì)算自由飲用組前1 d飲用量，按以下公式計(jì)算灌胃組的灌胃體積。配制30%及40%的DSS溶液，灌胃給予相應(yīng)體積的DSS溶液，每天1次。

2.2 小鼠UC模型的誘導(dǎo)除正常組外，各組采用對(duì)應(yīng)方式給予DSS，于小鼠開始出現(xiàn)明顯便血時(shí)停止造模，并繼續(xù)喂養(yǎng)至d 10處死。自由飲用組DSS溶液每2 d更換1次。

2.3 小鼠一般情況觀察及DAI評(píng)分記錄每天記錄小鼠體質(zhì)量、食量、毛色、精神狀態(tài)、糞便情況等。參考疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分規(guī)則[4]對(duì)小鼠體質(zhì)量、糞便性狀及大便隱血情況進(jìn)行評(píng)分。

2.4 樣本采集小鼠處死后，打開腹腔，分離并剪取整段結(jié)腸，整齊擺放于濾紙上，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度并記錄。小心剪取結(jié)腸中間部位約0.5-1.0 cm，生理鹽水迅速漂洗后置通用型組織固定液中固定過夜。隨后剪取小鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺進(jìn)行稱重并記錄，以臟器與體質(zhì)量的比值作為臟器指數(shù)。

Study on thickness control method of steel bar protective layer in main structure of metro stations in Qingdao

2.5 結(jié)腸病理組織切片制作及評(píng)分組織固定完全后，常規(guī)脫水、包埋、切片、染色。參考文獻(xiàn)方法[3]，鏡下觀察結(jié)腸組織炎癥程度、隱窩損傷、炎癥深度、炎癥浸潤(rùn)面積和病變深度并評(píng)分。

3 結(jié)果

3.1 小鼠死亡情況至實(shí)驗(yàn)d 6，除正常組外，各組小鼠普遍可見血便，提示造模成功，開始出現(xiàn)小鼠死亡，40%灌胃組d 6死亡5只，d 7死亡1只，至d 10死亡率達(dá)50%；30%灌胃組d 6、8、9各死亡1只，死亡率為25%。3%自由飲用組和4%自由飲用組至實(shí)驗(yàn)d 10均無小鼠死亡。

3.2 UC誘導(dǎo)情況自由飲用方式下，3%濃度組與4%濃度組對(duì)比：兩組小鼠體質(zhì)量及DAI評(píng)分均顯著高于正常組(Fig 1A,1C)。4%濃度組體質(zhì)量于d 4開始下降，3%濃度組于d 5開始下降；兩組DAI評(píng)分均于d 5達(dá)到最高值，3%濃度組總體高于4%濃度組，在d 5差異有顯著性(P<0.01)(Fig 1A,1C)。

灌胃方式下，30%濃度組與40%濃度組對(duì)比：40%濃度組體質(zhì)量于d 6顯著低于30%濃度組(P<0.05)，DAI評(píng)分于d 4顯著高于30%濃度組(P<0.01)(Fig 2A,2C)。

相同劑量下，30%灌胃和3%自由飲用兩種造模方式對(duì)比：兩組小鼠體質(zhì)量呈相似下降趨勢(shì)，從d 7起，灌胃組食量低于飲用組，飲用組及灌胃組DAI評(píng)分分別于d 5和d 6達(dá)到最高(Fig 3A,3B,3C)，飲用組DAI評(píng)分于d 5、8顯著高于灌胃組(P<0.05，P<0.01)(Fig 3C)。

相同劑量下，40%灌胃和4%自由飲用兩種造模方式對(duì)比：兩組小鼠體質(zhì)量呈相似下降趨勢(shì)，灌胃組DAI分別于d 2、7、9顯著高于飲用組(P<0.05，P<0.01)(Fig 4A,4B,4C)。

結(jié)腸大體觀察及組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，4個(gè)造模組結(jié)腸長(zhǎng)度均顯著降低，出現(xiàn)不同程度的上皮結(jié)構(gòu)破壞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、結(jié)締組織增生等病理變化，組織病理學(xué)評(píng)分均顯著升高。自由飲用方式下，4%濃度組病理學(xué)評(píng)分高于3%濃度組(P<0.01)；相同劑量下，30%灌胃組高于3%自由飲用組(P<0.01)(Fig 5A,5B)。

Fig 1 Body weight,appetite and DAI of mice under free drinking f.d.,free drinking.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group

Fig 2 Body weight,appetite and DAI of mice under intragastric n=12)i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 30% DSS i.g.group

Fig 3 Body weight,appetite and DAI of mice under the same dosage,with different administration f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group

Fig 4 Body weight,appetite and DAI of mice under the same dosage,with different administration n=12)f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 4% DSS f.d.group

Fig 5 Histological changes(A) and colon lengths(B) under different administration f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.**P<0.01 vs control;##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group

從臟器指數(shù)看，與正常組相比，各造模組肝臟指數(shù)無明顯變化，胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01)(Fig 6)；腎臟指數(shù)中，4%自由飲用組、30%灌胃組及40%灌胃組均有顯著升高(P<0.05，P<0.01)(Fig 6B)；4%自由飲用組脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.01)(Fig 6C)。相同劑量下，30%灌胃組腎臟指數(shù)顯著高于3%自由飲用組(P<0.05)；40%灌胃組脾臟指數(shù)顯著低于4%自由飲用組(P<0.01)(Fig 6C)。自由飲用方式下，4%濃度組脾臟指數(shù)顯著高于3%濃度組(P<0.01)( Fig 6C)。

3.3 4種造模方式數(shù)據(jù)變異系數(shù)對(duì)比為比較不同濃度及不同造模方式下動(dòng)物間表現(xiàn)的均一性，計(jì)算體質(zhì)量、DAI評(píng)分、臟器指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度和組織病理學(xué)評(píng)分的變異系數(shù)。自由飲用方式下，3%與4%濃度組體質(zhì)量變異系數(shù)變化趨勢(shì)相似，4%濃度組于d 8、9略高于3%濃度組(Fig 7A)；灌胃方式下，40%濃度組體質(zhì)量變異系數(shù)于d 9、10高于30%濃度45%以上(Fig 7C)。相同劑量下，從d 5起，3%自由飲用組體質(zhì)量變異系數(shù)高于30%灌胃組(Fig 7E)；40%灌胃組體質(zhì)量變異系數(shù)于d 10高于4%自由飲用組45%以上(Fig 7G)。

Fig 6 Organ indexes of mice under different administration n=12)f.d.,free drinking;i.g.,intragastric.*P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs 3% DSS f.d.group;△△P<0.01 vs 4% DSS f.d.group

DAI評(píng)分變異系數(shù)顯示，自由飲用方式下，3%與4%濃度組變異系數(shù)從d 2起無較大差異(Fig 7B)；灌胃方式下，d 3，40%濃度組高于30%濃度組，其余時(shí)間無較大差別(Fig 7D)。相同劑量下，3%自由飲用和30%灌胃組，前3 d自由飲用組變異系數(shù)高于灌胃組，d 4-d 10均無較大差別(Fig 7F)；4%自由飲用和40%灌胃組，d 1、2自由飲用組變異系數(shù)高于灌胃組，d 4-d 10均無較大差別(Fig 7H)。

臟器指數(shù)、結(jié)腸長(zhǎng)度及病理學(xué)評(píng)分變異系數(shù)顯示，各飲用組胸腺指數(shù)變異系數(shù)均略高于灌胃組；各組結(jié)腸長(zhǎng)度變異系數(shù)無較大差別。自由飲用方式下，3%濃度組病理學(xué)評(píng)分變異系數(shù)高于4%濃度組；相同劑量下，3%自由飲用和30%灌胃組病理學(xué)評(píng)分變異系數(shù)無較大差別，40%灌胃組病理學(xué)評(píng)分變異系數(shù)高于4%自由飲用組(Fig 8)。

Fig 7 Coefficient of variation of body weight and DAI under different administration free drinking;i.g.,intragastric

Fig 8 Coefficient of variation of organ index and colon lengths under different administration A：Control；B：3% DSS free drinking；C：4% DSS free drinking；D：30% DSS intragastric；E：40% DSS intragastric

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用3%和4% DSS溶液自由飲用、30%和40% DSS溶液灌胃4種方式建立小鼠UC模型，其中，30% 灌胃組和40%灌胃組灌胃劑量分別與3%飲用組和4%飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等。通過一般體征，DAI評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度、結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分等指標(biāo)評(píng)價(jià)模型復(fù)制情況，并通過上述指標(biāo)值的變異系數(shù)比較各造模方式下動(dòng)物間表現(xiàn)的均一性和模型穩(wěn)定性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種造模方式均能成功誘導(dǎo)UC模型，表現(xiàn)為顯著降低小鼠體質(zhì)量及結(jié)腸長(zhǎng)度，升高DAI評(píng)分及結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分等。其中，僅在結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分方面，30%灌胃組高于3%飲用組，4%飲用組高于3%飲用組，其余指標(biāo)未表現(xiàn)出顯著的嚴(yán)重程度差別。觀察還發(fā)現(xiàn)，30%灌胃組、40%灌胃組死亡率分別為25%、50%，飲用組無死亡，因此，自由飲用方式在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集、樣本收集方面有明顯優(yōu)勢(shì)。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，重癥UC病人可累及肝臟、腎臟與脾臟等器官，可能導(dǎo)致臟器積水，而胸腺為人體質(zhì)量要免疫器官，UC狀態(tài)下受損時(shí)可發(fā)生萎縮[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，UC小鼠胸腺指數(shù)較正常小鼠顯著降低，但各造模方式間差異無顯著性；脾指數(shù)4%飲用組高于3%飲用組，40%灌胃組高于4%飲用組；30%灌胃組腎臟指數(shù)高于3%飲用組。

變異系數(shù)是評(píng)價(jià)樣本數(shù)據(jù)離散程度的重要指標(biāo)。通過比較不同濃度及不同造模方式，尤其是相同劑量下自由飲用和灌胃方式各關(guān)鍵指標(biāo)的變異系數(shù)發(fā)現(xiàn)，小鼠出現(xiàn)明顯便血(約實(shí)驗(yàn)d 6)開始，自由飲用組體質(zhì)量變異系數(shù)總體略高于灌胃組，但DAI評(píng)分變異系數(shù)無明顯差別；結(jié)腸長(zhǎng)度變異系數(shù)在相同劑量自由飲用組和灌胃組間無較大差異；組織病理學(xué)評(píng)分變異系數(shù)3%自由飲用組略高于30%灌胃組，40%灌胃組約為4%自由飲用組的2倍。由此可見，在模型關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)方面，灌胃組動(dòng)物間表現(xiàn)的均一程度并不優(yōu)于自由飲用組。

在DSS口服誘導(dǎo)急性UC模型的應(yīng)用中，盡管2.0%-5.0% DSS水溶液自由飲用是推薦的最為常見的方式，但在實(shí)踐中仍受到關(guān)于模型穩(wěn)定性和動(dòng)物間表現(xiàn)均一性的質(zhì)疑。已有研究對(duì)自由飲用和灌胃兩種方式進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)3%DSS自由飲用組小鼠多項(xiàng)模型評(píng)價(jià)指標(biāo)變異系數(shù)明顯高于灌胃組(DSS灌胃劑量始終為4 g·kg-1)[6]。本實(shí)驗(yàn)室在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，自由飲用下，模型組小鼠的飲水體積隨著DSS的攝入表現(xiàn)出顯著下降趨勢(shì)，其下降幅度明顯超過體質(zhì)量降低幅度。以3%DSS溶液自由飲用為例，實(shí)驗(yàn)d 5，小鼠平均飲水量約為d 0的0.33倍，平均體質(zhì)量約為d 0的0.97倍，由此可見，在造模過程中，小鼠每天攝入DSS的量是動(dòng)態(tài)變化的。

因此，在本實(shí)驗(yàn)中，灌胃組晚于自由飲用組1 d開始給予DSS，灌胃劑量根據(jù)自由飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量進(jìn)行調(diào)整，即30%灌胃組和40%灌胃組灌胃劑量分別與3%飲用組和4%飲用組小鼠前1 d攝入DSS的平均劑量相等，盡可能模擬由已造成的損傷導(dǎo)致的飲水量和DSS實(shí)際攝入量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，相同劑量下，灌胃組多項(xiàng)指標(biāo)在動(dòng)物間的均一性，并未明顯優(yōu)于自由飲用組。究其原因，可能由于DSS攝入量超閾值后，總攝入量上較小的差異不會(huì)帶來模型嚴(yán)重程度的顯著差異[7]，或由于模型嚴(yán)重程度取決于用于造模的DSS濃度，而非DSS總攝入量[8-9]。另外，綜合考慮造模小鼠飲水量下降幅度遠(yuǎn)大于體質(zhì)量降低幅度的現(xiàn)象和本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，我們推測(cè)，在自由飲用DSS溶液造模過程中，小鼠個(gè)體差異帶來不同程度的結(jié)腸炎癥及一般體征改變，同時(shí)導(dǎo)致不同程度的飲水量變化，進(jìn)而影響后續(xù)DSS實(shí)際攝入劑量，比如結(jié)腸炎癥相對(duì)嚴(yán)重的小鼠，飲水量降低程度更大，相應(yīng)的，攝入DSS的劑量表現(xiàn)為更大程度的減少，在整個(gè)造模周期中，表現(xiàn)出DSS攝入劑量的動(dòng)態(tài)調(diào)整，轉(zhuǎn)而在一定程度上減輕了個(gè)體差異。

綜上所述，與灌胃法相比，3%和4% DSS溶液自由飲用能成功誘導(dǎo)小鼠UC模型，且動(dòng)物間表現(xiàn)較均一、死亡率低、操作方便，在UC模型制備中具有明顯優(yōu)勢(shì)；與3% DSS溶液自由飲用相比，4%自由飲用組各項(xiàng)指標(biāo)未見顯著優(yōu)勢(shì)，綜合考慮實(shí)驗(yàn)成本，3% DSS溶液自由飲用法是小鼠急性UC模型較合適的制備方法。