白楊素通過PI3K/AKT信號通路抑制LPS誘導的軟骨細胞自噬

楊 陽，何 宇，史于傳，舒見威，虞 樂，胡 偉

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 1.藥物臨床試驗研究中心、2.婦產(chǎn)科，3.麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學安徽省普通高校重點實驗室，安徽 合肥 230601)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性疾病，被認為2020年致殘的4個主要因素之一，并影響著全世界四分之一的中、老年人群[1]。OA臨床上主要癥狀為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬甚至殘疾，其病理為進行性關(guān)節(jié)軟骨降解、骨贅形成、軟骨下骨重建和滑膜炎癥[2]。OA的發(fā)病機制是多因素和復雜的，受維持關(guān)節(jié)損傷發(fā)展的信號級聯(lián)反應激活的影響，在OA疾病的發(fā)展中，已經(jīng)牽涉到活性氧(ROS)和相關(guān)信號通路的改變[3]。盡管長期以來首先將其歸類為一種主要是非炎癥性的關(guān)節(jié)疾病，其研究重點是生物力學方面和磨損和撕裂的不平衡，但是最新的免疫學的研究有助于改善對該疾病的解釋[4]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)也稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌的外膜成分，在組成性產(chǎn)生的外膜小泡中釋放，小泡中也含有蛋白質(zhì)。脂多糖在L929細胞核和巨噬細胞中誘導自噬[5]，在Xue等[6]的研究中發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路促進骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬并且減輕了炎癥反應。也有研究表明抑制PI3K/Akt信號通路可以改善骨關(guān)節(jié)炎的進展[7]。

白楊素(chrysin，CHR)屬于植物類黃酮化合物，它廣泛存在于蜂膠、蜂蜜、百香果中，甚至存在于蘑菇和其他植物來源中，抗氧化、抗炎、抗癌和抗病毒的活性，同時已被廣泛用于各種退行性疾病的治療，因此擁有巨大的經(jīng)濟價值和藥用價值[8,9]。有文獻報道，在OA的過程中伴隨著軟骨細細胞自噬，但白楊素對OA的治療作用暫未有文獻報道，且白楊素對自噬的作用機制尚未闡明，因此本研究旨在探索白楊素對LPS誘導軟骨細胞自噬的作用和機制。

1 材料

1.1 藥品與主要試劑白楊素(純度≥99.8%)(貨號：HY-14589)：購自Med Chem Express公司；脂多糖(貨號：SMB00610)：美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號：10565018)：美國Gibco公司；CCK-8(貨號：BS350B)：北京蘭杰柯科技有限公司；活性氧檢測試劑盒(貨號：S0033S)、RIPA裂解液(貨號：P0013C)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(貨號：P0015A)、BCA測定蛋白濃度試劑盒(貨號：P0012S)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；β-actin一抗(貨號：ab8226)、PI3K一抗(貨號：ab191606)、p-PI3K一抗(貨號：ab182651)、LC3B一抗(貨號：ab192890)、Beclin-1一抗(貨號：ab210498)：購于英國Abcam公司；AKT一抗(貨號：AF6261)、p-AKT一抗(貨號：AF0016)：購于美國Affinity公司。

1.2 主要儀器倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)；正置熒光顯微鏡(德國Zeiss)；全波長全自動酶標儀(美國Thermo)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)。

2 方法

2.1 大鼠軟骨細胞分離、培養(yǎng)和傳代軟骨細胞的提取：SPF級健康SD大鼠10只，♂，4周齡，體質(zhì)量110-130 g，購自山東省朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證號：SCXK(魯)20190003，大鼠分別飼養(yǎng)于室溫18 ℃-25 ℃的干燥層流室內(nèi)，頸椎脫位處死大鼠，將其浸泡于含75%醫(yī)用酒精中20 min。在無菌培養(yǎng)皿中加入含有1%雙抗的完全培養(yǎng)基。在無菌條件下將大鼠下肢截取，去除脂肪組織，同時將分離的膝關(guān)節(jié)留在培養(yǎng)皿上。分離關(guān)節(jié)軟骨，切除關(guān)節(jié)軟骨面和股骨頭，獲得肱骨頭表面軟骨。軟骨用培養(yǎng)基沖洗3次，然后用眼用剪刀切成1 mm3大小。再加入含0.25 % EDTA的胰蛋白酶，在37 ℃孵箱中消化軟骨組織，并輕輕搖晃1次。孵育30 min后加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，后加入0.2% Ⅱ 型膠原酶，37 ℃孵育4 h，用200目無菌尼龍網(wǎng)過篩，1 800 r·min-1離心5 min。隨后，去掉上清液，加入適量的新鮮培養(yǎng)基制備細胞懸液。細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5% CO2進行原代培養(yǎng)。隔天更換培養(yǎng)基，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。當細胞融合率達到80%時進行傳代培養(yǎng)。去掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細胞2次，加入含0.25%EDTA胰蛋白酶1 mL后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。在1 800 r·min-1離心5 min后，去掉上清液，將細胞重新懸浮在新鮮的完全培養(yǎng)基中，使其充分混合。最后，將細胞傳代到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

2.2 分組實驗分為四組，分別為空白對照組、LPS組、白楊素(CHR)組和LPS+CHR組，其中空白對照組僅加入完全培養(yǎng)基，LPS組加入LPS，CHR組加入白楊素，CHR+LPS組加入LPS與白楊素。

2.3 大鼠軟骨細胞的鑒定

2.3.1甲苯胺藍染色 將大鼠第3代關(guān)節(jié)軟骨細胞接種于有蓋玻片(4%多聚賴氨酸處理過)的六孔板中，每孔5×104個細胞，24 h后觀察細胞貼壁情況，并更換培養(yǎng)液，3 d更換1次培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察并攝片記錄。當細胞鋪滿蓋玻片60%-70%時取出蓋玻片，用PBS漂洗玻片3次，滴加4%多聚甲醛，在室溫下固定1 h，再用PBS緩沖液漂洗玻片3次，加入2%甲苯胺藍染色液室溫放置1 h，然后用雙蒸水漂洗至藍色基本消失，晾干后用中性樹脂封片，倒置顯微鏡觀察收集圖像。

2.3.2二型膠原免疫組織化學染色 將大鼠第3代關(guān)節(jié)軟骨細胞接種于有蓋玻片(4%多聚賴氨酸處理過)的6孔板中，每孔5×104個細胞，24 h后用10%多聚甲醛固定40 min，用PBS沖洗3次，每次3 min。之后添加50 mL 0.1% TritonX-100，并用PBS進行漂洗。細胞在室溫下用3% H2O2孵育10 min，用PBS進行洗滌3次。去除PBS緩沖液后，加入50 mL 5%封閉液室溫孵育30 min，向玻片中加入50 mL一抗(1 ∶200)，并在4 ℃下孵育過夜，然后用PBS清洗3次，每次3 min。加入50 mL的二抗室溫孵育30 min，用PBS洗滌。加入100 mL新制備的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液進行顯微鏡觀察。蓋玻片用自來水輕輕沖洗，細胞樣本用蘇木精復染1 min，用自來水沖洗，蓋玻片置于分級酒精中脫水。干燥的蓋玻片用二甲苯透明處理，并用中性樹脂粘合，將制備好的樣品用倒置顯微鏡觀察收集圖像。

2.4 白楊素劑量的篩選傳代至第二代的軟骨細胞在96孔板(每孔5×104個細胞)中培養(yǎng)24 h，加入LPS(100 μg·L-1),然后繼續(xù)在不同濃度的白楊素(0、5、10、20、40、80 mmol·L-1)中分別培養(yǎng)24 h、48 h。在規(guī)定的時間，用PBS清洗細胞，每孔添加100 μL DMEM，將10 μL的CCK-8溶液加入每個孔中，并在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。然后使用全自動酶標儀檢測，激發(fā)波長450 nm，重復3次以上實驗。

2.5 活性氧ROS的檢測取對數(shù)生長期的細胞，以2×106個·L-1的密度接種于6孔板，分別設置空白組(未處理)、模型組(LPS處理)、加藥組(CHR)、實驗組(LPS+ CHR)，預孵育LPS 2 h，CHR 處理24 h，按照1∶1 000的比例使用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA熒光探針，使DCFH-DA的終濃度為10 mmol·L-1，每孔加入2 mL稀釋的DCFH-DA探針培養(yǎng)基，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育細胞20 min后，棄去培養(yǎng)液，使用無血清DEME培養(yǎng)基清洗3次，充分洗滌細胞以除去未進入細胞的游離探針；于488 nm激發(fā)波長處使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光水平，并攝片。

2.6 Rhodamine 123線粒體膜電位檢測取對數(shù)生長期的細胞，以2×106個·L-1的密度接種于6孔板，分別設置空白組(未處理)、模型組(LPS處理)、加藥組(CHR)、實驗組(LPS+ CHR)，LPS預處理2 h，CHR處理48 h，按照1 ∶1 000的比例向每孔中加入1 μL的Rhodamine123染料原液，使Rhodamine 123的終濃度為1 mmol·L-1，37 ℃細胞培養(yǎng)箱孵育細胞30 min后，棄盡培養(yǎng)基，使用PBS洗滌3次，充分沖洗以除去多余染液，于488 nm激發(fā)波長處使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)熒光水平，并攝片。

2.7 Western blot取對數(shù)生長期的細胞以2×106L-1的密度接種于6孔板，分別設置空白組(未處理)、模型組(LPS處理)、加藥組(CHR)、實驗組(LPS+ CHR)；繼續(xù)培育24 h后，每孔加入150 μL蛋白裂解液(購自中國Beyotime)及蛋白酶抑制劑PMSF裂解30 min，加入150 μL 2×SDS 上樣緩沖液，干式恒溫器于100 ℃ 10 min，使用4%濃縮膠，12%分離膠進行SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉3 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育1 h，TBST清洗3次，3 min/次，使用Tanon imaging system進行成像。

3 結(jié)果

3.1 正常軟骨細胞形態(tài)倒置相差顯微鏡下觀察正常軟骨細胞的形態(tài)，新分離的軟骨細胞懸浮在液體培養(yǎng)基中呈圓形，原代大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)24 h，細胞呈橢圓形或梭形，貼壁生長，細胞膜完整光滑，折射率好(Fig 1A)；原代培養(yǎng)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)8 d，細胞呈長梭形、不規(guī)則型或樹突狀，多呈“鋪路石狀”，分布密集,甚至與可見的屈光性細胞外基質(zhì)融合成單層，細胞融合率達80%時進行傳代培養(yǎng)，傳代細胞具有快速生長和良好的基質(zhì)分泌能力(Fig 1B)。第一代軟骨細胞甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞核呈深藍色，核仁呈藍紫色，而軟骨細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)因其異染性而呈褐紅色(Fig 1C)。同時，對第一代軟骨細胞爬片進行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色，染色結(jié)果表明，由于軟骨細胞合成分泌的特異性Ⅱ型膠原被染色，細胞質(zhì)內(nèi)有大量可見的棕色顆粒，被染成棕色，證明分離的細胞為軟骨細胞(Fig 1D)。

3.2 CHR對正常軟骨細胞活性的影響白楊素的化學結(jié)構(gòu)如Fig 2A所示。采用CCK-8法檢測不同劑量的CHR對正常軟骨細胞的毒性作用。正常軟骨細胞在不同濃度的CHR(0、5、10、20、40、80 mmol·L-1)處理12和24 h，在處理12 h時，CHR各濃度對細胞活力沒有明顯影響(P>0.05)，見Fig 2B；在CHR處理24 h后，當CHR濃度≥40 mmol·L-1時，細胞活力受到明顯抑制(P<0.05)，而在CHR濃度為(5、10、20 mmol·L-1)對細胞活力無抑制作用,見Fig 2C。

Fig 1 Chondrocyte morphologies of normal rat knee cartilage observed with a microscope and identification of chondrocytes (×200)A:Primary rat articular chondrocytes cultured for 24 h;B：Primary rat articular chondrocytes cultured for 8 d;C:Toluidine blue staining for rat articular chondrocytes identification;D:Collagen Ⅱ immunocytochemistry staining for identification of rat articular chondrocytes.

3.3 LPS對正常軟骨細胞活力的影響用不同濃度LPS處理大鼠正常軟骨細胞24 h后，如Fig 3所示，當LPS的濃度為50 μg·L-1時對軟骨細胞的活力無影響，當LPS濃度為100 μg·L-1時可以明顯降低軟骨細胞的活力(P<0.01)，且當LPS的濃度不斷增大，大鼠軟骨細胞的活力不再繼續(xù)降低，因此，本實驗選擇用濃度為100 μg·L-1的LPS來誘導大鼠軟骨細胞損傷模型(Fig 3)。

3.4 CHR處理對LPS誘導的大鼠軟骨細胞細胞活性的影響用CCK-8法檢測CHR對LPS誘導的軟骨細胞損傷模型中細胞活力。軟骨細胞分別用未含有或者含有不同濃度CHR的培養(yǎng)基預處理2 h后，再用含有LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。由Fig 4顯示，與空白組比較，LPS刺激細胞后，細胞活力下降，而在CHR預處理的，細胞活力有所恢復，且在濃度為10 mmol·L-1的CHR處理24 h時細胞對LPS誘導的軟骨細胞損傷的增殖能力最強，CHR組(10 mmol·L-1)比LPS(100 μg·L-1)組的細胞活力明顯增加(P<0.01)。因此，我們選擇10 mmol·L-1的CHR作為后續(xù)實驗研究受試藥物有效使用濃度。

3.5 CHR對軟骨細胞活性氧(ROS)的影響本研究采用DCFH-DA探針來檢測大鼠軟骨細胞內(nèi)活性氧的水平。DCFH-DA能夠被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，細胞內(nèi)活性氧可以氧化DCFH生成有熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強度可以反映細胞內(nèi)的活性氧水平。實驗結(jié)果(Fig 5)表明，經(jīng)過LPS作用24 h后，能夠引起大鼠軟骨細胞內(nèi)活性氧水平明顯提高，CHR處理后可以明顯降低LPS誘導引起的活性氧水平。

Fig 2 Effects of different concentrations of chrysin on chondrocytes A:Chemical structure of chrysin;B:Cell viability of chondrocytes treated with chrysin for 12 hours;C:Cell viability of chondrocytes treated with chrysin for 24 hours;*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

Fig 3 Effects of different concentrations of LPS on viability of normal chondrocytes *P<0.05,**P<0.01 vs control group.

Fig 4 Effect of CHR treatment on activity of rat chondrocytes induced by LPS Cell viability after co-treatment with CHR and LPS for 24 hours.**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs LPS group.

3.6 CHR對軟骨細胞線粒體膜電位的影響用羅丹明123染色觀察線粒體膜電位，評估軟骨細胞狀態(tài)，可以在高膜電位的細胞中觀察到綠色熒光。LPS(100 μg·L-1)預處理，與Control組比較，LPS組細胞線粒體膜電位明顯下降，其線粒體膜電位低于Control組。CHR處理組可以恢復LPS處理后線粒體膜電位，與LPS組相比表達出更高的熒光強度，線粒體膜電位明顯提高(Fig 6)。

Fig 5 Changes in reactive oxygen species level of **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs LPS group.Scale bar:20 μm.

3.7 白楊素逆轉(zhuǎn)LPS暴露后對自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與LC3B的表達采用Western blot法檢測白楊素濃度為10 mmol·L-1時軟骨細胞的自噬蛋白的表達水平。Fig 7結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組Beclin-1、LC3Ⅱ的含量上升(P<0.5);與模型相比，CHR給藥可以明顯改善組軟骨細胞的自噬水平上升的情況，該差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果表明，CHR能抑制Beclin-1、LC3Ⅱ自噬蛋白的表達，進而起到抑制自噬的作用。

Fig 6 Fluorescence expression of mitochondrial membrane potential of cells under different treatment conditions **P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.Scale bar:20 μm.

3.8 白楊素對軟骨細胞PI3K/AKT信號通路的影響采用Western blot法檢測白楊素對PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表達的影響。結(jié)果如Fig 8所示，各組細胞總PI3K、AKT的蛋白含量差異無顯著性(P>0.05)，與Control組相比較LPS組的p-PI3K、p-AKT蛋白含量升高，差異有顯著性(P<0.05)；LPS+CHR組與LPS組相比，CHR給藥可以明顯降低p-PI3K、p-AKT蛋白含量，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果表明，CHR能夠抑制p-PI3K、p-AKT蛋白的表達。

Fig 7 Effect of chrysin on expression of autophagy markers A:The banding patterns of Beclin-1 and LC3Ⅱ by Western blot;B:The relative protein expressions of Beclin-1 and LC3Ⅱ;**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.

Fig 8 Total and phosphorylation levels of PI3K and AKT among four groups A:The banding patterns of PI3K and p-PI3K by Western blot;B:The relative protein expressions of PI3K and p-PI3K;C:The banding patterns of AKT and p-AKT;D:The relative protein expressions of AKT and p-AKT.**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs LPS group.

4 討論

骨關(guān)節(jié)炎致病過程中伴隨著關(guān)節(jié)腫脹、疼痛和活動性喪失，隨著中國人口衰老進程的加快，困擾著日益增多的中老年人日常生活[10]。傳統(tǒng)的骨關(guān)節(jié)炎治療主要是疼痛管理和晚期疾病的關(guān)節(jié)置換術(shù)。在骨關(guān)節(jié)炎中，自噬被認為是軟骨和細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要機制，其對骨關(guān)節(jié)炎的負效應和積極作用都有報道[11]。有研究報道，白楊素可以通過降低氧化應激改善粘菌素誘導的細胞損傷、凋亡和自噬[12]，在Mehmet的研究中，白楊素保護大鼠腎臟，降低撲熱息痛誘導的氧化應激、炎癥、凋亡和自噬[13-14],在本研究中，通過檢測ROS的水平和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ與Beclin-1的表達，提示白楊素可以保護軟骨細胞降低脂多糖誘導的軟骨細胞氧化應激和自噬。

在OA的早期階段，來自淺表區(qū)的軟骨細胞顯示凋亡細胞死亡和自噬標記的表達增加，有研究認為自噬是作為對致死條件的適應性反應而激活的，目的是避免細胞死亡。隨著退變過程的進展，這兩種標志物在淺層和中層軟骨細胞中的聯(lián)合表達可能與軟骨細胞修復反應的缺陷有關(guān)，這是由于死亡信號的激活增加，以及分解代謝機制的盛行。另一方面，研究證明了自噬的缺失和細胞凋亡的增加，這可能與OA晚期出現(xiàn)的軟骨異常鈣化相關(guān)的軟骨細胞的替代有關(guān)[15]。

細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生是軟骨細胞損傷的主要病理驅(qū)動因素，繼而在引發(fā)炎癥中起著至關(guān)重要的作用。LPS刺激可顯著增加軟骨細胞中的ROS水平(Fig 5)，降低細胞增殖能力(Fig 3、4)促進自噬(Fig 7A)。CHR處理不僅可以逆轉(zhuǎn)自噬相關(guān)蛋白的表達，增加活細胞的百分比，提高細胞活力(Fig 4)，而且還可以抑制ROS的產(chǎn)生。氧化應激的增加使軟骨細胞易發(fā)生抗功能性抗氧化反應和細胞自噬。因此，我們可以推測CHR通過減輕氧化應激來抑制受損軟骨細胞的損傷與自噬，而降低ROS可能是治療炎癥的潛在治療手段。在產(chǎn)生氧化損傷的同時我們通過Rhodamine123染色檢測了各組細胞的線粒體膜電位(Fig 6)，LPS組的細胞線粒體膜電位明顯低于正常組，CHR+LPS組的細胞線粒體膜電位明顯低于比LPS組的線粒體膜電位，說明在受到氧化應激損傷時，大鼠軟骨細胞的線粒體功能受到抑制，細胞活力下降；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)(Fig 7A),CHR+LPS組的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1與LC3Ⅱ的表達低于LPS組，說明在加入CHR后軟骨細胞的自噬水平下降；PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)多種細胞過程，包括細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管生成和細胞周期的調(diào)節(jié)，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)作為中間信號分子廣泛分布與各種細胞的細胞質(zhì)中，調(diào)節(jié)多種信號轉(zhuǎn)導途徑，并且可以被各種細胞因子受體激活[16]。PI3K/AKT信號通路蛋白在LPS處理后發(fā)生磷酸化活化，LPS組p-PI3K和p-AKT蛋白的表達增加被激活，CHR+LPS組中p-PI3K和p-AKT蛋白明顯低于LPS組，說明CHR可以抑制LPS對PI3K/AKT信號通路的激活作用。

由此可知，當PI3K/AKT信號通路中的磷酸化蛋白p-PI3K與p-AKT被抑制時，細胞自噬減弱，軟骨細胞活力增加。然而，由于本研究使用大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞，而不是大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型進行實驗，骨關(guān)節(jié)炎和大鼠軟骨細胞自噬之間的顯著關(guān)系仍有待確定。因此，需要進一步研究PI3K/AKT信號通路對大鼠軟骨細胞自噬的影響，以全面闡明軟骨細胞自噬的調(diào)節(jié)機制與研究進展，可為其臨床應用提供實驗依據(jù)，也可為天然黃酮類中藥化合物的現(xiàn)代開發(fā)應用提供新方向。