尋常型銀屑病不同證候外周血miR-146a的差異表達研究*

梁 育 沈丹丹 邱桂榮

銀屑病(Psoriasis Vulgaris，PV)，中醫(yī)稱為“白疕”，俗稱牛皮癬，以皮膚紅斑、丘疹或斑片上蓋有銀白色鱗屑，不同程度的瘙癢為主要表現(xiàn)。其發(fā)病機制非常復(fù)雜,目前認(rèn)為炎癥、表皮細(xì)胞過度增殖和免疫學(xué)異常是其發(fā)病機制的3個中心環(huán)節(jié)[1]。隨著國內(nèi)外學(xué)術(shù)界在miRNA領(lǐng)域研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)多種miRNA在皮膚生理病理等過程中發(fā)揮了極其重要的作用。通過前期研究我們也發(fā)現(xiàn)miRNAs在銀屑病皮損、單個核細(xì)胞中均存在特異性差異表達。近年來，對正常人與不同疾病的患者血漿中miRNAs進行檢測，發(fā)現(xiàn)存在差異性表達的miRNAs，并且隨著生理情況、疾病種類以及病程的長短而變化，這就證實血循環(huán)miRNA是潛在的診斷標(biāo)志物[2]。本人前期通過miRNA RealTime RT-PCR實驗驗證miRNA在正常人與銀屑病患者血漿中的表達差異，確定出5個差異倍數(shù)大于4的miRNA，其中miR-146a表達上調(diào)，且與銀屑病PASI積分呈正相關(guān)。故本次課題將研究人群擴大，不再是單純的血熱型患者，而是觀察不同中醫(yī)證候的銀屑病患者外周循環(huán)血miRNA-146a的差異性表達，以60例尋常型銀屑和20例健康人為研究對象，首先觀察個體中外周血miRNA-146a的表達水平，其次，將患者外周血中miRNA-146a的表達水平與其皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)作直線相關(guān)分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬皮膚科2018年6月—2019年6月門診和住院部確診為尋常型銀屑病的患者60例。將受試者按照中醫(yī)證候不同隨機分成3組，且性別、年齡必須經(jīng)處理差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：符合以上西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn)；年齡18～60歲者；無其他皮膚疾患及心、肝、肺、腎、血液等系統(tǒng)性疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于18歲或大于60歲者；妊娠或哺乳期婦女；對治療藥物過敏者；合并有心、肝、腎、腫瘤等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；4周內(nèi)未接受過糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、維A酸類及PUVA/UVB治療，2周內(nèi)未使用外用制劑局部治療者。

1.3 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及PASI評分法①具有典型的臨床表現(xiàn)：皮損以丘疹、斑丘疹和大小不等的紅色斑塊為主，覆有多層干燥銀白色鱗屑，刮除鱗屑可見一層發(fā)亮的薄膜，薄膜下可有點狀出血，不斷有新皮疹出現(xiàn)。進行期有同形反應(yīng)，好發(fā)于頭皮、四肢伸側(cè)及腰骶部，但可發(fā)生在體表各處，發(fā)于頭皮者，毛發(fā)呈束狀；發(fā)于甲板(指、趾)者，可有頂針樣甲損害。依皮損形態(tài)可分為點滴狀、錢幣狀、地圖狀或混合型；依病程可分為進行期、靜止期和退行期[3]。②PASI評分法：皮損情況依據(jù)Fredriksson T和Petersson U指定的皮損面積和嚴(yán)重性指數(shù)(Psoriasis area and severity index,PASI)評分法。

1.4 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參照中華中醫(yī)藥學(xué)會2012年頒布的《中醫(yī)皮膚科常見病診療指南》中白疕的辨證標(biāo)準(zhǔn)：①血熱內(nèi)蘊證。皮疹鮮紅，不斷出現(xiàn)，刮去鱗屑可見發(fā)亮薄膜，點狀出血，有同形反應(yīng)?？捎胁煌潭瑞W，伴有心煩口渴、尿黃、大便秘結(jié)。舌質(zhì)紅，舌苔黃或黃膩，脈弦滑或數(shù)。②血虛風(fēng)燥證。疹色淡紅，鱗屑較多而干燥，病程遷延日久，原發(fā)皮損部分消退。可有瘙癢、口干咽燥、大便干結(jié)。舌質(zhì)淡紅，苔薄白，脈細(xì)。③瘀滯肌膚證。皮損肥厚浸潤，顏色暗紅，鱗屑緊固。病程遷延，斑塊局限經(jīng)久不退，有不同程度瘙癢，舌質(zhì)暗紅，苔薄，脈細(xì)澀[4]。

1.5 方法

1.5.1 miRNA-146a的檢測抽取患者外周血5 ml，根據(jù)Trizol說明書進行總RNA提取，對其質(zhì)量檢測采用NanoDrop測定，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。然后對提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)步驟為：在PCR儀上16 ℃ 10 min，37 ℃ 30 min，65 ℃ 5 min，收集熒光。為盡量減小逆轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)及樣品間的差異，以看家基因RNU6為內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化樣品，分別進行目的基因和看家基因的PCR，數(shù)據(jù)采用 2-△Ct法進行分析。

1.5.2 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件包進行分析，定性資料用卡方檢驗，定量資料符合正態(tài)分布用t檢驗，不符合正態(tài)分布用秩和檢驗，相關(guān)性用Pearson相關(guān)性分析。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，以P≤0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組銀屑病患者與正常對照組外周血miRNA-146a的差異表達在3型尋常型銀屑病患者的PBMC中，miRNA-146a的相對表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.68，P<0.01)，miRNA-146a在血熱型患者表達水平高于血瘀組和血燥組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.34，P<0.01)，但血瘀組和血燥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表 1。

表1 各組受試者PBMC中miRNA-146a的表達水平

2.2 3組銀屑病患者外周血microRNA-146a的表達與PASI積分的相關(guān)性3組尋常型銀屑病患者的PBMC中miRNA-146a表達水平與銀屑病嚴(yán)重程度評分PASI呈正相關(guān)(r=0.68，P<0.05)。見圖1。

圖1 miRNA-146a與PASI積分的相關(guān)性

3 討論

銀屑病(Psoriasis Vulgaris，PV)是一種多因子遺傳模式的復(fù)雜疾病，涉及多個基因間的相互作用以及基因與環(huán)境的交互作用。從藥物治療手段上來看，維A酸類藥物、傳統(tǒng)免疫抑制劑、細(xì)胞/趨化因子抗體等藥物的作用靶環(huán)節(jié)相對單一以及各自不同的不良作用，使治療效果及臨床運用尚不能完全令人滿意。傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥對銀屑病的治療有著一定的優(yōu)勢，且對中醫(yī)證候的認(rèn)識也形成公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)。前輩先賢們多以“辨血為主，從血論治”[5，6]，且實踐證明這種辨證對于治療也是行之有效的。雖然中西醫(yī)的理論基礎(chǔ)不同，但研究對象是一致的，所以從某種意義上說，兩者之間必然存在著共同的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，我們需要尋找新的靶分子及適當(dāng)?shù)囊种仆緩?，從而為開辟銀屑病新的研究領(lǐng)域和探尋銀屑病新的治療手段提供理論依據(jù)。

miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的最小功能的非編碼小分子RNA，其參與了生命的一系列重要過程，包括發(fā)育進程、造血過程、脂肪代謝、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡等。以miRNA為靶點或者以miRNA為治療手段的研究也正在進行中，這些研究有助于人類疾病的早期診斷、療效及預(yù)后預(yù)測，同時也為人類疾病的治療提供了一種新的手段和方法[7]。miR-146a是一個在銀屑病中高表達的miRNA，作為一個負(fù)調(diào)控分子，可以通過互補結(jié)合于TRAF6和IRAK1的3’UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TRAF6和IRAK1的水平，從而對天然免疫應(yīng)答中的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[8]。

通過前期研究，我們發(fā)現(xiàn)miRNAs在血熱型銀屑病的皮損、外周血中均存在差異性表達，且與PASI呈正相關(guān)?？紤]疾病診治的整體性和全面性，且地域差異過于明顯，所以我們不再局限于血熱型患者，參考中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入了23例血熱型、20例血瘀型、17例血燥型患者，對其PMBCs中miRNA-146a的表達水平進行檢測，并將結(jié)果與患者PASI積分作直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示在3型尋常型銀屑病患者的PBMCs中，miRNA-146a的相對表達水平明顯高于對照組，且血熱型患者表達水平高于血瘀組和血燥組患者，但血瘀組和血燥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且miRNA-146a的表達水平與銀屑病嚴(yán)重程度評分(PASI)呈正相關(guān)。

綜上所述，miRNA-146a的水平與銀屑病患者臨床皮損癥狀嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可以作為判斷病情和臨床治療效果的生物學(xué)指標(biāo)之一?？紤]到所有研究對象均來自同一所醫(yī)院，這可能會影響研究對象的代表性，造成地區(qū)選擇上的偏倚。另外，納入的樣本量相對較小，可能會削弱研究結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義，故下一步有必要擴大樣本量研究。