miR-1260a調(diào)控FEZ1對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

孫彥申 張躍

前列腺癌是臨床常見惡性腫瘤之一，調(diào)查顯示我國前列腺癌發(fā)病率逐年上升，前列腺癌發(fā)生發(fā)展與致癌基因、抑癌基因等異常表達(dá)密切相關(guān)[1,2]。微小RNA(microRNA，miRNA)可通過與靶mRNA結(jié)合從而參與癌癥、心血管疾病等多種疾病發(fā)生過程[3,4]。因而探究前列腺癌發(fā)生發(fā)展的原因及引起的機(jī)制對提高治療效果具有重要意義。研究表明，微小RNA-1260a(microRNA-1260a，miR-1260a)在前列腺患者中高表達(dá)[5]。但miR-1260a對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚未見報(bào)道。TargetScan預(yù)測顯示亮氨酸拉鏈蛋白(fasciculation and elongation protein zeta-1，F(xiàn)EZ1)可能是miR-1260a的靶基因，研究表明，miR-1260a是一個(gè)抑癌基因并可抑制腫瘤增殖[6]。研究報(bào)道指出，F(xiàn)EZ1過表達(dá)可誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡及抑制增殖[7]。但miR-1260a是否通過調(diào)控FEZ1的表達(dá)影響前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為尚未可知。本研究主要探討miR-1260a對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響及機(jī)制，分析其對FEZ1的調(diào)控作用，以期為前列腺癌的分子診斷及靶向治療提供新的治療方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年6月至2019年1月于本院診治的前列腺癌患者46例為研究對象，患者均經(jīng)病理證實(shí)為前列腺癌，年齡50～70歲，平均年齡(65.25±5.64)歲，所有患者接受手術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療或化療，本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。術(shù)中切除前列腺癌組織及其癌旁組織，放入液氮中保存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 材料與試劑 前列腺癌DU145細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫。杜氏改良培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；miR-1260a特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-1260a)及其陰性對照(anti-miR-NC)、miR-1260a模擬物(mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、FEZ1小干擾RNA(si-FEZ1)、無意義陰性序列(si-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自日本TaKaRa公司；甲基噻唑基四唑(methylthiazolyl tetrazolium，MTT)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Mgtrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；蛋白裂解液與二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)、B淋巴細(xì)胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)、P21、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、上皮鈣黏附素(E-cadherin)抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組:前列腺癌DU145細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2，收集對數(shù)生長期DU145細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液種于24孔板，待細(xì)胞生長融合至70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)分組：anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)、anti-miR-1260a組(anti-miR-1260a轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)、anti-miR-1260a+si-NC組(anti-miR-1260a與si-NC共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)、anti-miR-1260a+si-FEZ1組(anti-miR-1260a與si-FEZ1共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)。為探究miR-1260a靶向調(diào)控FEZ1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分組：miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)、miR-1260a組(miR-1260a mimics轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)、anti-miR-NC組(anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)、anti-miR-1260a組(anti-miR-1260a轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞)。4組細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測細(xì)胞中miR-1260a的表達(dá)水平:取出凍存前列腺癌組織與癌旁組織及各組細(xì)胞，采用Trizol法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR-1260a正向引物5’-ATCCCACCTCTGCCACCA-3’，反向引物：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，參照試劑盒配置反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃ 2 min(循環(huán)1次)，95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 30 s(循環(huán)40次)。miR-1260a以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1260a的相對表達(dá)量。

1.3.3 MTT檢測細(xì)胞增殖:收集4組對數(shù)生長期DU145細(xì)胞，胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個(gè)/ml，按照每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔分別加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，置于振蕩儀低速振蕩10 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值(OD 490 nm)，以O(shè)D值大小表示細(xì)胞活力。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:取4組對數(shù)生長期DU145細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，室溫條件下1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min，棄上清，預(yù)冷PBS清洗，加入500 μl結(jié)合緩沖液，加入5 μl膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)，充分混勻，加入5 μl碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移:取對數(shù)生長期DU145細(xì)胞，棄上清，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/ml，按照每孔200 μl將細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，擦拭未遷移細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲:預(yù)備實(shí)驗(yàn)：預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel基質(zhì)膠(9∶1)，按照每孔加入40 μl Matrigel稀釋液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。實(shí)驗(yàn)步驟：取對數(shù)生長期DU145細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/ml，按照每孔200 μl單細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，取600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入Transwell小室的下室，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，擦去未侵襲細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測:TargetScan預(yù)測顯示miR-1260a與FEZ1存在結(jié)合位點(diǎn)，將結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)載入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-FEZ1、突變型載體MUT-FEZ1，取對數(shù)生長期DU145細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為4組：WT-FEZ1與miR-NC共轉(zhuǎn)染組、WT-FEZ1與miR-1260a mimics共轉(zhuǎn)染組、MUT-FEZ1與miR-NC共轉(zhuǎn)染組、MUT-FEZ1與miR-1260a mimics共轉(zhuǎn)染組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測4組相對熒光素酶活性。

1.3.8 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、P21、Bax、E-cadherin、FEZ1蛋白表達(dá):收集4組DU145細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg變性蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，室溫條件下孵育一抗稀釋液，4℃孵育過夜，TBST洗滌，孵育二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫條件下孵育1 h，TBST洗滌，曝光，顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-1260a在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，前列腺癌組織中miR-1260a的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 miR-1260a在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1260a組前列腺癌DU145細(xì)胞中miR-1260a的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，P21、Bax蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。見圖1，表2、3。

圖1 抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響;A 抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145凋亡的影響;B 抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表2 抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145增殖的影響

表3 抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145凋亡的影響

2.3 抑制miR-1260a對細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1260a組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.01)，MMP-2蛋白表表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。見表4，圖2。

表4 抑制miR-1260a對細(xì)胞遷移、侵襲的影響

圖2 抑制miR-1260a對細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

2.4 miR-1260a靶向、調(diào)控FEZ1的表達(dá) TargetScan預(yù)測顯示FEZ1的3’UTR含有miR-1260a的互補(bǔ)序列。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染克隆有FEZ1-3’UTR突變型載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-1260a組與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染克隆有FEZ1-3’UTR載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-1260a組熒光素酶活性明顯受到抑制，與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Western blot檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-1260a組DU145細(xì)胞中FEZ1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-1260a組DU145細(xì)胞中FEZ1蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。表明miR-1260a可靶向調(diào)控FEZ1的表達(dá)。見表5、6，圖3。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表6 miR-1260a調(diào)控FEZ1的表達(dá)

圖3 miR-1260a靶向、調(diào)控FEZ1;A FEZ1的3’UTR含有miR-1260a的互補(bǔ)序列；B miR-1260a調(diào)控FEZ1的表達(dá)

2.5 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響 與anti-miR-1260a+si-NC組比較，anti-miR-1260a+si-FEZ1組DU145細(xì)胞活力顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，P21、Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。見表7、8，圖4。

表7 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145增殖蛋白表達(dá)的影響

表8 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145凋亡、遷移、侵襲的影響

圖4 抑制FEZ1能逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a對細(xì)胞DU145增殖的影響

3 討論

前列腺癌早期診斷方法主要為直腸指檢、前列腺癌特異性抗原等，腫瘤分期等可作為判斷患者預(yù)后的主要指標(biāo)，但僅依靠臨床病理指標(biāo)不可準(zhǔn)確評估前列腺癌患者預(yù)后[8]。因而積極探尋敏感性與特異性較高的分子標(biāo)志物可為前列腺癌靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。既往研究顯示miR-214、miR-188-5p等miRNA在前列腺癌中異常表達(dá)，并可影響前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)行為[9,10]。但仍有部分miRNA在前列腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。

miR-1260a在黑色素瘤等多種腫瘤中均呈高表達(dá)，并可能影響腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[11,12]。但miR-1260a在前列腺癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果顯示前列腺癌組織中miR-1260a的表達(dá)水平顯著升高，提示miR-1260a的表達(dá)水平升高可能促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以前列腺癌DU145細(xì)胞為研究對象，檢測抑制miR-1260a的表達(dá)對DU145細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達(dá)可顯著降低DU145細(xì)胞活力，說明抑制miR-1260a的表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖。研究表明，P21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期，并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G1期，Cyclin D1在多種腫瘤中表達(dá)增加，并可通過增加CDK活性從而促進(jìn)細(xì)胞生長，P21可抑制Cyclin D1與CDK的活性[13]。本研究結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達(dá)后DU145細(xì)胞中P21的表達(dá)水平顯著升高，Cyclin D1的表達(dá)水平顯著降低，提示抑制miR-1260a的表達(dá)可通過上調(diào)P21的表達(dá)及下調(diào)Cyclin D1蛋白的表達(dá)而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達(dá)后前列腺癌細(xì)胞凋亡率顯著升高。研究表明，抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因[14]。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-1260a的表達(dá)后前列腺癌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，Bax的表達(dá)水平顯著升高，提示抑制miR-1260a的表達(dá)可通過上調(diào)Bax的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡。研究表明，E-cadherin表達(dá)水平降低可減弱細(xì)胞間的黏附從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，MMP-2表達(dá)水平升高可降低細(xì)胞外基質(zhì)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[15]。本研究結(jié)果顯示抑制miR-1260a的表達(dá)后DU145遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，并可降低MMP-2的表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，提示抑制miR-1260a的表達(dá)可通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)及下調(diào)MMP-2的表達(dá)從而抑制前列腺癌細(xì)胞遷移及侵襲。

FEZ1在食管癌、口腔鱗癌等腫瘤中均呈低表達(dá)并可發(fā)揮抑癌基因作用，研究表明，F(xiàn)EZ1的表達(dá)降低可促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。研究表明，F(xiàn)EZ1在宮頸癌中呈低表達(dá)，其低編導(dǎo)量與患者總生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[17,18]。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)FEZ1是miR-1260a的靶基因，miR-1260a可負(fù)性調(diào)控靶基因FEZ1的表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)抑制FEZ1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-1260a的表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。提示抑制miR-1260a的表達(dá)可通過上調(diào)FEZ1的表達(dá)，從而達(dá)到抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的目的，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-1260a在前列腺癌中呈高表達(dá)，并可能通過抑制FEZ1的表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，為揭示前列腺癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制提供新方向，可為前列腺癌的分子靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但仍需從動(dòng)物模型與臨床研究分析miR-1260a與FEZ1對前列腺癌嚴(yán)重程度、治療效果及患者預(yù)后的預(yù)判價(jià)值。