新疆地區(qū)酒精依賴患者HTR3A 和HTR3B 基因多態(tài)性與 酒依賴的相關(guān)性分析＊

趙志強，肖萌，蘇瑩，林凱，徐向東

（1.烏魯木齊市第四人民醫(yī)院成癮醫(yī)學科，新疆 烏魯木齊 830002； 2.新疆大學軟件學院，新疆 烏魯木齊 830046）

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2010 年的不完全統(tǒng)計，在世界大多數(shù)國家（53.9%）酒精是社會中最容易獲得和濫用的物質(zhì)，這一事實可能與酒精容易獲得和合法使用的特點有關(guān)。酒精依賴癥（AD）通常是由長期大量飲酒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其臨床表現(xiàn)主要為對酒精的過度渴求和需要飲酒的強迫性體驗，并以身體對長期飲酒的自我調(diào)節(jié)為特征。它的發(fā)生與生物學、心理和社會環(huán)境密切相關(guān)，其中生物學因素可能是其產(chǎn)生的基礎(chǔ)[1-4]。大量研究表明[5-6]，酒精依賴患者在運動功能和記憶、注意、執(zhí)行、社會認知等方面存在缺陷，從而給個體和社會造成嚴重負擔[7-8]。因此，作為一個重要的公共衛(wèi)生問題，我們必須進一步研究該病的病因和發(fā)病機制，以便進行有效的預防和控制。

大量研究證實[9-10]，酒精依賴具有明顯的遺傳易感性。這些數(shù)據(jù)是通過雙胞胎研究、寄養(yǎng)兒童研究以及神經(jīng)生化研究獲得的，這表明酒精依賴是一種復雜的多基因遺傳病。研究發(fā)現(xiàn)，40%～60%的酒精依賴是由遺傳因素造成的，男性的遺傳能力遠遠高于女性[11]。研究還表明，酒精使用障礙的表型變異中有50%～60%與基因相關(guān)[12]。由此可見，遺傳因素對酒精依賴的發(fā)生有著非常重要的影響。

隨著分子遺傳學的發(fā)展，對酒精依賴的易感基因或致病基因的相關(guān)遺傳學研究迅速展開。目前，人們認為與酒精相互作用的主要神經(jīng)遞質(zhì)包括血清素、多巴胺（DA）[13]、γ -氨基丁酸（GABA）和內(nèi)源性阿片受體。這些參與酒精強化作用的各種神經(jīng)遞質(zhì)相互作用影響大腦，其中5-HT 在酒精的獎勵、偏好、依賴和渴求中起主要作用。

5-HT 在人腦中廣泛分布，參與各種生理功能和病理狀態(tài)的調(diào)節(jié)，包括睡眠、飲食、情感和精神。研究發(fā)現(xiàn)，血清素受體5-HT3 與酒精渴求、中毒、上癮和其他酒精相關(guān)疾病有關(guān)。其中，我們發(fā)現(xiàn)酒精可以直接與5-HT3受體離子通道受體結(jié)合，在可引起中毒的濃度范圍內(nèi)增強離子電流[14]。Le 等人在對白色封閉群大鼠（Wistar）的研究中發(fā)現(xiàn)[15]，在大鼠進行了12%的酒精自我訓練28～31 天后，停藥9～10 天后，在5-HT 拮抗劑預給藥后，大鼠電擊后的酒精自我給藥明顯減少。因此，酒精和5-HT3 受體的作用部位可能是治療酒精依賴和其他物質(zhì)成癮的主要靶點。

SNP 在人類基因組學中廣泛存在[16]，由于其信息量大、易于自動檢測和分析，已成為第三代遺傳標記。SNP 是導致個體之間在疾病易感性和藥物反應(yīng)方面存在顯著差異的主要原因之一。不同地區(qū)或種族的SNP在頻率和類型上存在著實質(zhì)性的差異，這意味著在一個特定群體的正常個體基因組中，任何SNP 的特定核苷酸位置具有不同的堿基，并且其最低等位基因頻率不應(yīng)少于1%[17-18]。大量的基因關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)證實HTR3A 和HTR3B 與酒精依賴有關(guān)。Chamindi 和Bankole 等人研究發(fā)現(xiàn)rs10160548 和rs1176719 與物質(zhì)成癮及依賴有關(guān)，rs1176713 在歐美人群中與酒精依賴有關(guān)，HTR3A 基因上的rs176713、rs10160548、rs1176719 和HTR3B 基因上的rs4938056、rs3782025 對酒精依賴也存在影響[19-21]。

新疆地區(qū)人群長期生活在中國的西北地區(qū)，他們生活在古絲綢之路上，在歐亞大陸的人類遷徙和進化中發(fā)揮了重要作用[22]?；诂F(xiàn)有理論，本研究旨在確定新疆地區(qū)酒精依賴患者HTR3A 和HTR3B 的基因多態(tài)性，以進一步探討5-HT 相關(guān)基因在酒精依賴中的作用?；蛟诰凭蕾囍械淖饔茫瑸檫M一步的基因研究和酒精依賴的精確治療提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究人群

我們選取了2018 年1 月—12 月在新疆精神衛(wèi)生中心（烏魯木齊市第四人民醫(yī)院）成癮醫(yī)學科住院的199例患者。參與本次調(diào)查的患者均為男性，符合《國際疾病及相關(guān)健康問題統(tǒng)計分類（第10 版）》“酒精使用 障礙引起的心理和行為”診斷標準。所有被試年齡在18 歲以上，文化程度在初中以上，能夠充分理解問卷的相關(guān)內(nèi)容并能夠在沒有幫助的情況下完成評估。我們排除了患有器質(zhì)性精神障礙的患者和無法合作完成此評估的患者。正常對照組為18～60 歲的健康男性志愿者。他們同意參與研究，簽署書面知情同意書，并使用隨機抽取的審計量表評估（AUDIT）酒精濫用或依賴的嚴重程度（少于8 分除外）。排除標準如下：患有嚴重的 心、肝、腎、內(nèi)分泌和其他身體疾病的患者；患有嚴重精神障礙和其他腦器質(zhì)性精神障礙的患者；具有導致退縮或無法完成調(diào)查的所有其他因素的患者。

調(diào)查和隨訪的結(jié)果基于患者參與的原則，獲得患者或患者監(jiān)護人的知情同意，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)新疆精神衛(wèi)生中心醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 數(shù)據(jù)收集

本研究血樣及一般人口社會學調(diào)查均由新疆精神衛(wèi)生中心（烏魯木齊市第四人民醫(yī)院）成癮科醫(yī)務(wù)人員獨立完成。每個研究對象均提供3～5 ml 外周血樣本，并且均同意研究目的和實驗程序。研究方案是根據(jù)赫爾辛基宣言進行的，并得到了醫(yī)院人類研究委員會的批準。

1.3 SNP 選擇和基因分型

在查閱了之前的文獻報道和NCBI 搜索后，我們從研究中總共選取了20 個SNP 進行遺傳分析。 它們位于HTR3A 和HTR3B 基因中，并且具有最小的等位基因頻率（MAF＞5%）。使用GoldMag?反粒子法（中國西安金磁有限公司），根據(jù)說明書從血液中提取基因組DNA 樣本，使用Nano drop 2000C 測定DNA 濃度（Thermo Scientific, Waltham, USA, Massachusetts）。 使用Sequenom MassARRAY Assay Design 3.0 軟件（美國加州圣地亞哥）設(shè)計多SNP MassEXTEND 分析。使用Sequenom MassARRAY RS1000 對SNP 基因型進行分型（美國加州圣地亞哥），使用Sequenom Typer 4.0 軟件（美國加州圣地亞哥）進行數(shù)據(jù)管理和分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

我們使用Microsoft Excel（Redmond，華盛頓，美國）和SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包（SPSS 在芝加哥，伊利諾伊州，美國）進行所有的統(tǒng)計分析。所有統(tǒng)計檢驗均為雙相檢驗，并且P ≤0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。使用對照之間的精確測試來評估每個tSNP 頻率是否偏離哈迪-溫伯格平衡（HWE）（P＞0.05），我們利用χ2檢驗比較病例和對照組之間的基因型頻率和等位基因頻率。為了估計遺傳多態(tài)性和酒精依賴風險之間的關(guān)系，我們使用了無條件邏輯回歸，并根據(jù)年齡和性別進行了調(diào)整，估計了比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）。在對照中，調(diào)用最常見的基因型作為參考等位基因。我們使用多元邏輯回歸模型（共顯性、顯性、隱性、過顯性和加性）來評估某些SNP 與酒精依賴之間的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 一般人口統(tǒng)計特征和哈迪-溫伯格平衡

共有396 名受試者參與了調(diào)查和研究，均符合條件并參與到研究結(jié)束。病例組平均年齡為（42.51±10.36）歲，對照組平均年齡為（42.15±9.08）歲。在對所有位點進行哈迪-溫伯格平衡定律分析后，P 值均大于0.05（表1）。研究對象的基本特征均記錄。兩組之間在年齡分布或受教育程度方面無顯著差異，但是婚姻狀況存在顯著差異。

表1 關(guān)于SNP 的HWE 結(jié)果和基本信息

2.2 SNP 與酒精依賴風險之間的聯(lián)系

野生型等位基因相對于每個SNP 的次要等位基因是危險因素。使用χ2檢驗，有三個SNP 被認為與酒精依賴的發(fā)生率顯著相關(guān)。在基因型模型中，rs10160548與酒精依賴風險顯著相關(guān)（P=0.014）；在顯性模型中，當個體的rs2276305 攜帶“A”等位基因時，酒精依賴的風險增加（OR=2.09, 95%CI=1.02-1.31, P=0.042）。Rs1176722 可能是酒精依賴風險增加的位點（等位基因模型：OR=1.58, 95%CI=1.04-2.40, P=0.032）（表2）。經(jīng)過Fisher 檢驗，rs10160548 和rs1176722 與酒精依賴風險之間的相關(guān)性仍然顯著（表3）。其他與酒精依賴風險無顯著相關(guān)性的SNP 結(jié)果另表記錄。

表2 SNP 等位基因和基因型模型的卡方檢驗結(jié)果

續(xù)表

表3 Fisher 檢驗后SNP 等位基因和基因型模型的卡方檢驗結(jié)果

2.3 SNP 與酒精依賴風險之間的邏輯模型分析

我們進一步評估了20 個SNP 在5 個邏輯模型（等位基因、顯性、隱性、基因型和加性）中酒精依賴的風險（表4）?；蛐蜑镚T 的Rs10160548 增加了基因型模型中酒精依賴的可能性（OR=1.66, 95%CI=1.08-2.56, P=0.021）。對于A 等位基因，rs1176722 在等位基因模型中（OR（95%CI）=1.576（1.038-2.394）, P=0.033），在加性模型中（OR（95%CI）=1.63（1.055-2.517）, P=0.028）增加了酒精依賴的風險。Rs2276305 在基因型模型（GA 基因型：OR（95%CI）=2.186（1.035-4.619）, P=0.040）和顯性模型（AA/AG, OR（95%CI）=2.091（1.015-4.311）, P=0.046）中與酒精依賴有顯著相關(guān)性。經(jīng)過邏輯模型校正分析，這三個SNP 的相對疾病風險仍然存在（表5）。

表4 Logistic 回歸模型中與AD 相關(guān)的SNP 的Logistic 分析

表5 校正后Logistic 回歸模型中與AD 相關(guān)的SNP 的Logistic 分析

3 討論

我們探索了新疆地區(qū)人群中HTR3A 和HTR3B 基因的SNP 與酒精依賴風險的相關(guān)性。我們的研究支持了5-HT 在酒精依賴的發(fā)病機制中起重要作用的觀點。我們發(fā)現(xiàn)HTR3A（rs1176722 和rs10160548）和HTR3B（rs2276305）與新疆地區(qū)患者的酒精依賴顯著相關(guān)，這表明HTR3A 和HTR3B 可能參與了這些個體的遺傳易感性。

Rs1176722（IVS1-19G＞A）位于HTR3A 基因序列的內(nèi)含子區(qū)域[22]。我們的研究顯示，病例組與對照組之間存在顯著差異，HTR3A 是發(fā)現(xiàn)的第一個5-HT3 受體亞基。它最早由Maricq 等人于1991 年從倉鼠胚胎腦細胞和成神經(jīng)細胞瘤小鼠的雜交細胞系NCB-20 中克隆出來[23]。HTR3A 基因跨度約為15 kb，包含9 個外顯子，大小在45～845 bp 之間，通過編碼標準的5-HT3A亞基，我們觀察到該亞基由478 個氨基酸組成[24]。另有研究報道HTR3A 基因序列位于染色體11q23 上[25]。在本研究中，該部位顯著增加了酒精依賴的風險。為了進一步研究其功能，有必要在大樣本中進一步驗證這一發(fā)現(xiàn)。由于rs1176722 不參與內(nèi)含子區(qū)域蛋白的直接表達，因此有必要對其可能的調(diào)控機制進行研究。我們發(fā)現(xiàn)Rs10160548 的G 等位基因與新疆地區(qū)個體對酒精依賴的易感性有關(guān)，該位點位于HTR3A 基因的第6 個內(nèi)含子與外顯子連接的位置，可以通過改變基因的剪接位置來研究其對疾病的影響。在以前涉及該方面的研究 中[26]，通過相同的機制導致非洲裔美國人對煙草的依賴程度增加，該結(jié)果得到了本研究的支持。

我們研究的第三個主要發(fā)現(xiàn)是HTR3B 基因5 外顯子的低頻同義變體rs2276305 與酒精依賴顯著相關(guān)。在全球范圍內(nèi)，很少有關(guān)于rs2276305 與酒精依賴之間關(guān)系的分析。在一些關(guān)于尼古丁和酒精依賴的研究中，HTR3B 基因rs2276305（A/G）多態(tài)性與成癮、依賴的嚴重程度和某些癥狀有關(guān)[27]。

我們首次發(fā)現(xiàn)HTR3A 和HTR3B 與新疆地區(qū)人群酒精依賴的發(fā)生密切相關(guān)，它們位于染色體11q23 上。關(guān)于HTR3A、HTR3B 與酒精依賴之間關(guān)系的研究并不多，在一些研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)酒精通過增加組蛋白脫羧酶活性而增加5-HT3 受體的基因表達。其他研究發(fā)現(xiàn)，長期飲酒會影響HTR3A 等基因的甲基化水平。一些研究還發(fā)現(xiàn)[28-29]，在酒精依賴患者中，HTR3A 和HTR3B基因突變與酒精使用障礙和反社會人格障礙有關(guān)。結(jié)合我們對酒精依賴的發(fā)病機理的研究，我們推斷HTR3A和HTR3B 在酒精依賴的發(fā)病機理中起關(guān)鍵作用。

4 結(jié)論

我們對新疆地區(qū)人群中HTR3A 和HTR3B 基因SNP 與酒精依賴關(guān)系的初步研究表明，rs10160548、rs1176722 和rs2276305 與酒精依賴的風險有關(guān)。雖然本研究取得了一些預期的結(jié)果，但仍存在一些局限性。首先，作為基因SNP 的病例對照關(guān)聯(lián)分析，本研究的樣本量相對較小。其次，酒精依賴者和健康對照者在年齡和受教育程度方面無統(tǒng)計學差異，但是婚姻狀況的差異具有統(tǒng)計學意義。最后，我們選擇了20 個SNP 位點進行關(guān)聯(lián)分析。雖然它們經(jīng)過篩選并結(jié)合先前文獻報道被選擇為SNP 位點，但不足以反映全部基因信息。

本次研究樣本量較小，所入組的患者也均為男性，故存在樣本量偏移的問題，加之觀察時間尚短，還需要進一步擴大樣本量、多中心、長病程的完善相關(guān)實驗。

利益競爭聲明

作者聲明，他們沒有已知的可能影響這篇論文所報道的工作的相互競爭的經(jīng)濟利益或個人關(guān)系。

致謝

本研究工作得到了新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市科技計劃（Y16130026）支持