姜黃素通過Nrf2信號通路對H2O2誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的緩解

姜春暉，孫旭東，唐燕，羅勝繽，徐闖，陳媛媛

姜黃素通過Nrf2信號通路對H2O2誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的緩解

姜春暉，孫旭東，唐燕，羅勝繽，徐闖，陳媛媛

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319

【】驗(yàn)證姜黃素是否能夠通過轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）信號通路減輕H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激，為防治圍產(chǎn)期奶牛代謝紊亂導(dǎo)致的氧化損傷提供理論依據(jù)。培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞（MAC-T），用500 μmol·L-1H2O2處理MAC-T細(xì)胞24 h后加入不同濃度的姜黃素（0、5、15或30 μmol·L-1）處理3 h；MAC-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA 48 h后，用500 μmol·L-1H2O2處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞系MAC-T細(xì)胞24 h后加入不同濃度的姜黃素（0、5、15或30 μmol·L-1）處理3 h。采用實(shí)時定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）、蛋白免疫印跡（Western blot，WB）和試劑盒等方法，檢測Nrf2的蛋白表達(dá)量及下游靶基因NAD（P）H醌氧化還原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO1）和血紅素加氧酶1（Heme oxygenase 1，HO-1）的mRNA及蛋白表達(dá)量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的活性及含量。（1）H2O2處理組MAC-T細(xì)胞中MDA含量顯著高于對照組（<0.01），而CAT、SOD和GSH-Px的活性顯著低于對照組（<0.01）。15 μmol·L-1姜黃素+H2O2共同處理組和30 μmol·L-1姜黃素+H2O2共同處理組MAC-T細(xì)胞中MDA的含量顯著低于H2O2處理組（<0.01），而CAT、SOD和GSH-Px的活性顯著高于H2O2處理組（<0.05，<0.01）。（2）H2O2處理組總Nrf2蛋白水平顯著低于對照組（<0.01），H2O2處理組Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表達(dá)量也顯著低于對照組（<0.01）。姜黃素處理組總Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組（<0.01），姜黃素處理組HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表達(dá)量也顯著高于對照組（<0.01）。姜黃素+H2O2處理組總Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著高于H2O2處理組（<0.01），姜黃素+H2O2處理組HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表達(dá)量也顯著高于H2O2處理組（<0.01）。（3）si-Nrf2組與對照組相比，Nrf2的mRNA表達(dá)水平顯著降低（<0.01）。si-Control+H2O2+姜黃素組與si-Control+H2O2組相比，MDA的含量顯著降低（<0.01），而CAT、SOD和GSH-Px的活性顯著升高（<0.01）。si-Nrf2+H2O2+姜黃素處理組與si-Control+H2O2+姜黃素組相比，MDA的含量顯著升高（<0.01），而CAT、SOD和GSH-Px活性顯著降低（<0.01）。姜黃素可以通過增加Nrf2的表達(dá)，誘導(dǎo)下游抗氧化分子的轉(zhuǎn)錄從而緩解H2O2誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激。本研究為防治圍產(chǎn)期奶牛代謝紊亂導(dǎo)致的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷提供理論依據(jù)。

姜黃素；奶牛；乳腺上皮細(xì)胞；氧化應(yīng)激；Nrf2

0 引言

【研究意義】近些年來，隨著我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)不斷向規(guī)?；⒓s化發(fā)展，圍產(chǎn)期奶牛代謝性疾病的發(fā)病率也隨之增加。從妊娠后期到泌乳前期，隨著胎兒的生長發(fā)育及泌乳啟動，奶牛機(jī)體對能量和營養(yǎng)的需求增加，而采食量卻減少，導(dǎo)致能量負(fù)平衡[1]。此時奶牛啟動脂肪動員，誘發(fā)高非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA）血癥和高酮血癥，致使脂肪肝、酮病等代謝性疾病的發(fā)生[2]。在負(fù)能量平衡期間，大量的NEFA和酮體隨血液進(jìn)入乳腺以滿足產(chǎn)奶的能量需求[3]。研究發(fā)現(xiàn)高NEFA血癥導(dǎo)致奶牛乳腺組織產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），過量的ROS會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，致使乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷[4]。作為維持奶牛泌乳的基本功能單位，乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷會造成乳腺功能受損，產(chǎn)奶量顯著降低，嚴(yán)重影響奶業(yè)健康發(fā)展。因此，如何緩解圍產(chǎn)期奶牛代謝應(yīng)激導(dǎo)致的乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，提高其產(chǎn)奶量和生產(chǎn)性能，已成為當(dāng)前我國奶牛生產(chǎn)中的一大焦點(diǎn)問題?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf 2）是機(jī)體重要的內(nèi)源性保護(hù)分子。該分子通過調(diào)節(jié)NAD（P）H醌氧化還原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1，NQO1）和血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）等氧化分子的表達(dá)從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[5]。張倩研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf 2信號通路可以增加HO-1、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化分子的表達(dá)水平從而緩解H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)激活Nrf 2信號通路可以緩解H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激[7]，表明Nrf 2信號通路可能是保護(hù)奶牛乳腺上皮細(xì)胞免受氧化損傷的潛在治療靶標(biāo)。因此，篩選Nrf 2信號通路的調(diào)節(jié)藥物是防治圍產(chǎn)期奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷研究的必要環(huán)節(jié)。姜黃素[Curcumin，1，7-二-（4-羥基-5-甲氧基苯基）-1，6-庚二烯-3，5-二酮]是姜黃根莖的提取物，是姜黃的主要活性成分之一[8-9]。因?yàn)榻S素具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)和獸醫(yī)領(lǐng)域。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可抑制脂質(zhì)過氧化并有效清除超氧陰離子和羥基自由基[10-12]。除了其清除氧自由基的能力外，姜黃素還具有增強(qiáng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的作用[13]。這些研究表明姜黃素具有較強(qiáng)的抗氧化能力。此外，體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過激活Nrf2信號通路緩解腎功能不全大鼠腎臟的氧化應(yīng)激[14]。體外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過激活Nrf2信號通路增加SOD活性并降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量從而緩解H2O2誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激[15]。【本研究切入點(diǎn)】這些研究說明姜黃素可以通過激活Nrf2信號通路緩解氧化應(yīng)激，但姜黃素是否可以通過激活Nrf2信號通路緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞添加H2O2，建立氧化應(yīng)激模型，轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA并添加不同濃度的姜黃素，檢測Nrf2及其下游基因：NQO1、HO-1的表達(dá)量，并檢測SOD、GSH-Px、CAT和MDA等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的活性及含量，旨在探討姜黃素對H2O2誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響及其分子機(jī)制，為防治圍產(chǎn)期奶牛代謝紊亂導(dǎo)致的氧化損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年8－12月在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物群發(fā)性普通病監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 主要試劑及儀器

Eagle培養(yǎng)基（HG-DMEM，Pierce Hyclone，F(xiàn)remont，CA，美國）；胎牛血清（美國紐約州格蘭德島）；H2O2（Sigma）；SOD、GSH-Px、CAT和MDA檢測試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所）；Trizol（Takara Biotechnology Co.，Ltd，大連，中國）；K5500顯微分光光度計（北京凱奧科技發(fā)展有限公司，北京，中國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa生物技術(shù)有限公司，東京，日本）；SYBR green plus試劑盒（Roche，Norwalk，CT，美國）；BCA試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，北京，中國）；熒光定量PCR儀（7500 Real-Time PCR系統(tǒng)Applied Biosystems）；RIPA裂解液（Beyotime，江蘇，中國）；ECL化學(xué)發(fā)光溶液（Pierce Biotechnology Inc.，美國芝加哥）；一抗Nrf2（Abcam；1﹕1 000）；HO-1（Abcam；1﹕1 000）；NQO1（Abcam；1﹕1 000）；β-actin（Abcam；1﹕1 000）；二抗（博士德生物，武漢，中國）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

奶牛乳腺上皮細(xì)胞系（MAC-T）培養(yǎng)在含100 U·mL-1青霉素，100 g·mL-1鏈霉素和10％（v/v）胎牛血清（美國紐約州格蘭德島）的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。每隔24 h換液一次。根據(jù)先前的研究選擇了H2O2的濃度和處理時間[4]。用500 μmol·L-1H2O2處理MAC-T細(xì)胞24 h后加入不同濃度的姜黃素（0、5、15或30 μmol·L-1）處理3 h。姜黃素的濃度和處理時間參照文獻(xiàn)[16]處理。

1.4 Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染及細(xì)胞處理

根據(jù)文獻(xiàn)[7]方法設(shè)計靶向Nrf 2編碼區(qū)和非靶向陰性對照的siRNA，并由上海基因化學(xué)有限公司（中國上海）合成。Nrf 2 siRNA引物序列為：CTGGAGCA AGATTTAGATCAT，ATGATCTAAATCTTGCTCCAG。胰蛋白酶消化細(xì)胞，將2×106細(xì)胞/mL在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。在37 ℃下孵育5 min后，將siRNA和lipofectamine混合，在室溫下再孵育20 min，然后添加到每個孔中。轉(zhuǎn)染12 h后更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)36 h后，將細(xì)胞用于隨后的分析或處理。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 氧化應(yīng)激指標(biāo) 棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗后，收集細(xì)胞。根據(jù)制造商的說明書測定細(xì)胞中SOD、GSH-Px和CAT的活性以及MDA的含量，在560 nm（SOD）、420 nm（GSH-Px）、405 nm（CAT）和532 nm（MDA）讀取吸光值。

1.5.2 RNA分離和實(shí)時定量PCR（qPCR） 培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，采用RNAiso Plus（TaKaRa，D9108A）總RNA提取試劑盒提取RNA，將1 μmol·L-1RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR green plus試劑盒在7500 Real-Time PCR系統(tǒng)檢查靶基因的表達(dá)量；用2-ΔΔCT方法計算各基因的相對表達(dá)量。本研究中所用引物見表1。

1.5.3 Western blot 使用RIPA裂解液（Beyotime，江蘇，中國）提取MAC-T細(xì)胞總蛋白，并用BCA試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，中國，北京）測定蛋白含量。將30 μg的蛋白經(jīng)過12% 的SDS-PAGE電泳分離后，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜放入配置好的3%BSA溶液中室溫下封閉4 h。4 ℃條件下?lián)u床孵育一抗（Nrf2、HO-1、NQO1和β-actin；抗體均按照1﹕1 000稀釋）過夜，然后室溫條件下孵育二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體；均按照1﹕5 000稀釋）40 min。使用ECL發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

表1 Real-time PCR分析所用引物

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。*表示差異顯著（<0.05），**表示差異極顯著（<0.01）。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素緩解H2O2引起的氧化應(yīng)激

用不同濃度姜黃素作用于經(jīng)H2O2處理過的MAC-T細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，使用試劑盒檢測MDA含量及CAT，SOD和GSH-Px的活性。與對照組相比，H2O2處理組MAC-T細(xì)胞中MDA含量顯著升高（圖1-A；<0.01），而CAT、SOD和GSH-Px的活性顯著降低（圖1-B—D；<0.01）。與H2O2處理組相比，15 μmol·L-1或30 μmol·L-1姜黃素和H2O2共同處理組MAC-T細(xì)胞中MDA（圖1-A；<0.01）的含量顯著降低，而CAT，SOD和GSH-Px的活性顯著升高（圖1-B—D；<0.05，<0.01）。

2.2 姜黃素激活了Nrf2信號通路

將經(jīng)H2O2處理好的細(xì)胞加入經(jīng)上一試驗(yàn)所示的最佳濃度姜黃素（30 μmol·L-1），繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，檢測總Nrf2蛋白和下游基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，H2O2處理組總Nrf2的蛋白水平顯著降低（圖2-A和B；<0.01）。然而，與對照組相比，姜黃素處理組總Nrf2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖2-A和B；<0.01）。與H2O2處理組相比，姜黃素+H2O2處理組總Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖2-A和B；<0.01）。與對照組相比，H2O2處理組Nrf2的下游基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低（圖3-A—E；< 0.01）。與對照組相比，姜黃素處理組的HO-1和NQO1的mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著升高（圖3-A—E；<0.01）；與H2O2處理組相比，姜黃素+H2O2處理組的HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高（圖3-A—E；<0.01）。

A：MDA含量；B：CAT活性；C：SOD活性；D：GSH-PX活性。*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。下同

2.3 姜黃素通過Nrf2緩解H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

將細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-Nrf2處理 48 h 后，用500 μmol·L-1H2O2處理MAC-T細(xì)胞24 h后加入姜黃素（30 μmol·L-1）處理3 h，采用qPCR方法檢測Nrf2 mRNA表達(dá)水平；使用試劑盒檢測MDA含量及CAT，SOD和GSH-PX的活性。結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，si-Nrf2組Nrf2的mRNA表達(dá)水平顯著降低（圖4-A；<0.01）。與si-Control+H2O2組相比si-Control+H2O2+姜黃素組中MDA的含量顯著降低（圖4-B；<0.01），而CAT、SOD和GSH-Px的活性顯著升高（圖4-C—E；<0.01）。然而，與si-Control+H2O2+姜黃素組相比si-Nrf2+H2O2+ 姜黃素處理組MDA的含量顯著升高（圖4-B；<0.01），而CAT、SOD和GSH-Px活性顯著降低（圖4-C—E；<0.01）。

A：Nrf2蛋白條帶；B：Nrf2蛋白表達(dá)水平 A: Western blot analysis of Nrf2; B: Relative protein level of Nrf2

A：HO-1 mRNA表達(dá)水平；B：NQO1 mRNA表達(dá)水平；C：HO-1和NQO1蛋白條帶；D：HO-1蛋白表達(dá)水平；E：NQO1蛋白表達(dá)水平

3 討論

圍產(chǎn)期對于奶牛的健康、生產(chǎn)和盈利能力至關(guān)重要[17]。在此期間，由于奶牛存在嚴(yán)重的代謝應(yīng)激導(dǎo)致脂肪肝、酮病、乳腺炎和子宮內(nèi)膜炎等生產(chǎn)性疾病的發(fā)病率升高。在產(chǎn)后，由于奶牛開始泌乳，大量的NEFA隨血液進(jìn)入使乳腺組織難以滿足能量需求。而過量的NEFA可以增加活性氧代謝產(chǎn)物ROS的產(chǎn)生[18]。當(dāng)ROS的生成量超過ROS的清除能力時，就會發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的過氧化誘發(fā)乳腺組織損傷，致使奶牛泌乳能力降低。因此，提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力對防治圍產(chǎn)期奶牛乳腺組織氧化應(yīng)激，維持奶牛的健康和產(chǎn)奶性能有著至關(guān)重要的意義[19]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)中草藥對氧化應(yīng)激具有明顯的治療效果，而且能避免藥物殘留等問題，因而應(yīng)用中草藥治療奶牛乳腺組織氧化損傷一直被寄予厚望。姜黃素是姜黃的主要活性成分，作為香料和著色劑廣泛應(yīng)用于食品中[20]。體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種藥理作用和生物學(xué)活性[21]。由于姜黃素具有類黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)，姜黃素可以通過抑制脂質(zhì)過氧化并中和超氧化物、羥基自由基和一氧化氮等ROS而發(fā)揮抗氧化作用。據(jù)報道，姜黃素可抑制脂質(zhì)過氧化，從而緩解H2O2誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激[22]。此外，鄭媛媛等研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過降低MDA含量并增加GSH從而緩解大鼠肝臟星狀細(xì)胞的氧化應(yīng)激[16]。與鄭媛媛等報道一致，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與H2O2處理組相比，姜黃素和H2O2共同處理組MAC-T細(xì)胞中MDA的含量顯著降低，而CAT，SOD和GSH-Px的活性顯著升高，說明姜黃素是通過增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化的能力來緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激。但本研究采用的H2O2處理誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激模型是否可以模擬圍產(chǎn)期奶牛體內(nèi)條件尚不清楚，因此需進(jìn)一步研究姜黃素對圍產(chǎn)期奶牛乳腺組織氧化應(yīng)激的作用。

Nrf 2是抗氧化應(yīng)激最重要轉(zhuǎn)錄因子之一，通過調(diào)節(jié)抗氧化分子的表達(dá)而發(fā)揮抗氧化作用[23]。正常生理條件下，Nrf 2通過與細(xì)胞質(zhì)中Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）形成復(fù)合物而呈失活狀態(tài)[24]。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1解離，隨后Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中與ARE結(jié)合，從而調(diào)節(jié)NQO1和HO-1等抗氧化劑基因轉(zhuǎn)錄[25-26]。Balogun等報道，姜黃素導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離，促進(jìn)豬腎上皮近端小管細(xì)胞中HO-1的表達(dá)[27]。此外，飼料中添加亞麻粉可以增加奶牛的乳腺組織中Nrf2 mRNA表達(dá)量，說明亞麻粉通過增加Nrf2表達(dá)而增強(qiáng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力[28]。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Nrf2通過增加SOD和GSH-Px活性并降低ROS含量緩解H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[7]，表明Nrf2信號通路在調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理可以增加MAC-T細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)量，并增加及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)量，說明姜黃素可以激活Nrf 2信號通路，試驗(yàn)結(jié)果與其他報道一致[29-30]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)通過降低Nrf 2，增加MAC-T細(xì)胞中MDA的含量，降低CAT，SOD和GSH-Px的活性，從而抑制姜黃素的抗氧化功能，表明姜黃素通過Nrf 2信號通路緩解H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以緩解H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激。姜黃素通過增加抗氧化酶的活性，降低細(xì)胞毒性產(chǎn)物丙二醛的含量，增加總Nrf2蛋白的表達(dá)量及其下游基因HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表達(dá)量，發(fā)揮抗氧化作用。沉默Nrf 2后降低姜黃素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激保護(hù)作用。說明姜黃素可通過激活Nrf 2信號通路，增加抗氧化分子的表達(dá)，緩解H2O2誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。

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Curcumin Alleviates H2O2-Induced Oxidative Stress in Bovine Mammary Epithelial Cells Via the Nrf2 Signaling Pathway

JIANG ChunHui,SUN XuDong, TANG Yan, LUO ShengBin, XU Chuang,Chen YuanYuan

College of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang

【】The aim of this study was to investigate whether curcumin alleviated oxidative stress in bovine mammary epithelial cells induced by H2O2via the nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) signaling pathway.【】Bovine mammary epithelial cells MAC-T cells were treated with H2O2(500 μmol·L-1) for 24 h, followed by incubation of curcumin (0, 5, 15 or 30 μmol·L-1) for an additional 3 h; the MAC-T cells were transfected with Nrf2 siRNA for 48 h, followed by incubation of H2O2(500 μmol·L-1) for 24 h and then treated with curcumin (30 μmol·L-1) for an additional 3 h. Real-time quantitative PCR (qPCR), Western blot (WB) were used to detect the protein abundance of Nrf2 and the mRNA and protein abundance of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) and Heme oxygenase 1 (HO-1), the activity of superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and the content of malondialdehyde (MDA). 【】(1) Compared with the control group, H2O2treatment significantly increased MDA content (<0.01), while it decreased the activity of SOD, GSH-Px, and CAT (<0.01). Compared with the H2O2group, the content of MDA in MAC-T cells in the 15 μmol·L-1or 30 μmol·L-1curcumin with H2O2treatment groups was significantly decreased (<0.01), while the activity of SOD, GSH-Px, and CAT were significantly increased (<0.05,<0.01). (2) Compared with the control group, H2O2treatment significantly decreased Nrf2 protein abundance (<0.01) and decreased HO-1 and NQO1 their mRNA and protein abundance (<0.01). However, compared with the control group, curcumin treatment significantly increased Nrf2 protein abundance (<0.01) and increased HO-1 and NQO1 mRNA and protein abundance (<0.01). Compared with the H2O2group, H2O2+curcumin treatment significantly increased Nrf2 protein abundance (<0.01) and increased HO-1 and NQO1 mRNA and protein abundance (<0.01). (3) Compared with the control group, si-Nrf2 treatment group significantly decreased Nrf2 mRNA abundance (<0.01). Compared with si-Control+H2O group, the content of MDA was significantly decreased in si-Control+H2O2+curcumin treatment group (<0.01), while the activity of SOD, GSH-Px, and CAT were significantly increased (<0.01). However, comparedwith si-Control+H2O2+curcum group, the content of MDA was significantly increased in si-Nrf2+H2O2+curcumin treatment group (<0.01), while the activity of SOD, GSH-Px, and CAT were significantly decreased (<0.01).【】These results suggested that curcumin could alleviate the oxidative stress of bovine mammary epithelial cells induced by H2O2through increasing the expression of Nrf2 and inducing the transcription of downstream antioxidant molecules. This study provided a theoretical basis for the prevention and treatment of oxidative damage of mammary epithelial cells caused by metabolic disorderd in perinatal dairy cows.

curcumin; bovine; mammary epithelial cells; oxidative stress; Nrf2

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.017

2020-05-06；

2021-01-25

國家自然科學(xué)基金（31672622）、中國博士后科學(xué)基金（2019M661316）、黑龍江博士后科學(xué)基金（LBH-Z19090）、黑龍江八一農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)成、引進(jìn)人才科研啟動計劃項目（XYB201909）

姜春暉，E-mail：jiangchunh0606@163.com。孫旭東，E-mail：sunxudong0323@163.com。姜春暉與孫旭東為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者徐闖，E-mail：xuchuang7175@163.com。通信作者陳媛媛，E-mail：18249636785@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）