利用熒光SSR分子標(biāo)記評(píng)估中國栗屬植物遺傳多樣性

聶興華，鄭瑞杰，趙永廉，曹慶芹,4，秦嶺,4，邢宇,4

利用熒光SSR分子標(biāo)記評(píng)估中國栗屬植物遺傳多樣性

1北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2遼寧省經(jīng)濟(jì)林研究所，遼寧大連 116000；3北京市懷柔區(qū)板栗技術(shù)試驗(yàn)與推廣站，北京 102206；4林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 102206

【】利用SSR分子標(biāo)記研究中國栗屬植物遺傳多樣性、親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，為栗屬植物的資源改良、種質(zhì)創(chuàng)新與利用提供理論依據(jù)。利用不同產(chǎn)區(qū)的12個(gè)板栗品種對(duì)330個(gè)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得高質(zhì)量的12對(duì)SSR引物。隨后在高分辨率的毛細(xì)管電泳上對(duì)栗屬4個(gè)種的96份資源進(jìn)行位點(diǎn)信息檢測。用Power Marker 3.25、GenAlEx 6.51、FigTree v1.4.3和Structure 2.3.3對(duì)全部資源進(jìn)行群體遺傳多樣性的相關(guān)分析。對(duì)96份資源進(jìn)行檢測，共獲得129個(gè)等位變異，每個(gè)標(biāo)記平均有10.750個(gè)位點(diǎn)變異。位點(diǎn)多樣性（GD）變幅為0.656（CmSI0396）—0.877（CmSI0930），平均為0.800；觀察雜合度（Ho）變幅為0.329（CmSI0742）—0.769（CmSI0702），平均為0.615；期望雜合度（He）變幅為0.489（CmSI0742）—0.789（CmSI0922），平均為0.672；多態(tài)信息含量（PIC）變幅為0.586（CmSI0396）—0.868（CmSI0930），平均為0.774。從不同栗屬植物種群間的遺傳多樣性來看，茅栗種群的觀察位點(diǎn)數(shù)（Na）、有效等位變異（Ne）和Shannon多樣性指數(shù)最高，其次是板栗種群，最低是日本栗種群。從兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)（Fst）可知，栗屬植物種間的遺傳分化值在0.077—0.180，整體種群間存在中等以上程度的分化，板栗種群、錐栗種群與日本栗種群間的遺傳分化值分別為0.165和0.180，表現(xiàn)出較大的遺傳分化。同時(shí)，栗屬植物種群的基因流（Nm）為1.580>1，也說明種群間存在較頻繁的基因交流，由此降低了由基因遺傳漂變所引起的各種群間遺傳分化程度。分子方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，占總變異量的73%，種群間的變異占27%。UPGMA聚類分析、主坐標(biāo)分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果較一致，各資源的遺傳背景存在明顯的種間界限，部分資源在世代遺傳中繼承了不同祖先種的遺傳信息。例如，資源65、71和82號(hào)為混合類型資源，包含有茅栗和日本栗的遺傳背景，而現(xiàn)在的兩種間存在地理隔離。在相同生態(tài)區(qū)域的栗屬植物種間存在一定的基因交流，沒有形成完全的生殖隔離。48號(hào)資源‘廣東矮生’同時(shí)含有板栗和茅栗的遺傳背景，在地理分布上該資源原生地正處于板栗和茅栗資源的重疊生態(tài)區(qū)。篩選的12對(duì)SSR引物能夠準(zhǔn)確地評(píng)估中國栗屬植物的遺傳多樣性，綜合聚類分析可確定栗屬植物的類群劃分與種間信息高度一致且種間存在一定的基因交換。

SSR；栗屬；聚類分析；群體遺傳結(jié)構(gòu)；群體遺傳分化

0 引言

【研究意義】目前世界公認(rèn)的栗屬植物有板栗（Bl.）、錐栗（(Skam) Rehd. et Wils.）、茅栗（Dode）、日本栗（S. et Z.）、歐洲栗（Mill.）、美洲栗（(Marsh.) Brokh.）和美洲榛果栗（Mill.）7個(gè)種[1]。20世紀(jì)以來，墨水病和栗疫病嚴(yán)重打擊了曾經(jīng)盛極一時(shí)的歐洲栗和以材用為主的美洲栗，造成歐洲栗出現(xiàn)生產(chǎn)危機(jī)和幾乎全境的美洲栗瀕于滅絕[2]。中國分布板栗、茅栗、錐栗和日本栗（遼東栗）4個(gè)種的資源，且分布十分廣泛，跨越溫帶、暖溫帶和亞熱帶，同時(shí)我國栗屬資源對(duì)栗疫病、墨水病等表現(xiàn)出較好的抗性，具有最為豐富的遺傳多樣性[2-3]。由于長期的自然和人工選擇，中國栗屬植物不僅具有很高的食用品質(zhì)，還為世界各地栗屬植物的基因改良提供了重要的來源，在世界栗屬種質(zhì)資源中占有不可代替的地位[4]。因此，了解中國栗屬種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，評(píng)估各種間資源的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)栗屬植物優(yōu)異種質(zhì)的創(chuàng)新與開發(fā)有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，研究者們已經(jīng)開發(fā)出了諸多第二代和第三代分子標(biāo)記，并將其廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性、遺傳圖譜和基因組分析中[5-7]。例如隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（RAPD）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、簡單序列重復(fù)（SSR）和三代標(biāo)記單核苷酸多態(tài)性（SNP）等。其中，SSR串聯(lián)重復(fù)序列的突變率非常高，能形成高度多態(tài)的等位變異[8]。此外，SSR標(biāo)記具有共顯性、穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可從物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組測序中開發(fā)獲得。在栗屬植物的最新研究中，SSR主要用于遺傳多樣性研究、關(guān)聯(lián)分析和遺傳圖譜的構(gòu)建等領(lǐng)域。INOUE等[9]利用17個(gè)SSR標(biāo)記成功進(jìn)行了中國板栗、日本栗和歐洲栗跨種間的擴(kuò)增，3個(gè)物種中的65個(gè)樣品表現(xiàn)出相當(dāng)高的遺傳多樣性。JIANG等[10]對(duì)中國10個(gè)省的95個(gè)板栗品種進(jìn)行基于SSR的分析，評(píng)估了中國板栗的遺傳多樣性，遺傳結(jié)構(gòu)模式和連鎖不平衡（LD）。MULLER等[11]利用24個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)272個(gè)美洲栗個(gè)體進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)特異的位點(diǎn)與種群所在地的環(huán)境變量存在顯著的相關(guān)性。KUBISIAK等[12]創(chuàng)建了一個(gè)基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)的330個(gè)SSR和1 071個(gè)SNP標(biāo)記組成的板栗遺傳圖譜，通過QTL關(guān)聯(lián)分析篩選獲得3個(gè)抗病區(qū)段。此外，劉國彬等[13]利用13對(duì)SSR分子標(biāo)記對(duì)北京懷柔區(qū)的33株明清古板栗樹進(jìn)行了指紋圖譜構(gòu)建?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】中國作為栗屬植物的遺傳多樣性中心，豐富的栗屬植物資源在農(nóng)業(yè)生態(tài)建設(shè)和區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)創(chuàng)收方面發(fā)揮著重要作用。但栗屬植物優(yōu)異種質(zhì)的開發(fā)與利用還有很大的局限性，以往的研究多集中在單個(gè)種的遺傳多樣性，而對(duì)中國栗屬植物的遺傳多樣性研究相對(duì)較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用高質(zhì)量的SSR標(biāo)記評(píng)估96份中國栗屬植物資源的遺傳多樣性，并解析不同栗屬種質(zhì)資源的親緣關(guān)系、群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳背景，為栗屬植物優(yōu)異種質(zhì)的創(chuàng)新與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選引物的材料

試驗(yàn)中篩選引物所需的12份板栗品種材料于2019年在北京市懷柔區(qū)板栗技術(shù)試驗(yàn)與推廣站進(jìn)行選?。娮痈奖?）。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中供試材料于2019年在我國不同地區(qū)的資源圃和野外進(jìn)行收集，共計(jì)96份（表1、電子附表2），包括板栗、錐栗、茅栗和日本栗4個(gè)種。其中板栗50份，采自北京市懷柔區(qū)板栗技術(shù)試驗(yàn)與推廣站；錐栗13份，采自福建省建甌市錐栗接穗圃；野生茅栗資源19份，采自安徽、江西、湖南和湖北等省的野外；日本栗14份，采自遼寧省經(jīng)濟(jì)林研究所栗屬植物資源圃。每份材料采集嫩葉6片，液氮處理后，保存于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 板栗基因組DNA提取方法采用本實(shí)驗(yàn)室的CTAB改良方法[14]。提取DNA后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nano Drop One分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，USA）分別測試DNA的質(zhì)量和濃度。然后將每份DNA的濃度稀釋至20—50 ng?μL-1以備PCR擴(kuò)增使用。

表1 供試材料的地理分布

1.3.2 EST-SSR分子標(biāo)記的來源 SSR分子標(biāo)記來源于美國林木基因組（https://www.hardwoodgenomics. org/）公布的中國板栗EST-SSR庫。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)庫中的330個(gè)EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行初篩，引物由擎科生物科技有限公司合成。

1.3.3 普通SSR-PCR擴(kuò)增體系 PCR擴(kuò)增采用10 μL反應(yīng)體系：4 μL ddH2O，4 μL TaKaRa公司生產(chǎn)的2×Taq PCR Master Mixes，上、下游引物各0.5 μL，1 μL模板DNA（20—50 ng?μL-1）。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，10℃保存。

1.3.4 PAGE凝膠制備與位點(diǎn)信息檢測 凝膠檢測參照本試驗(yàn)室優(yōu)化的PAGE凝膠制備與位點(diǎn)檢測方法[15]。

1.3.5 熒光毛細(xì)管電泳SSR-PCR擴(kuò)增體系 PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系：其中包含1 μL模板DNA（20—50 ng?μL-1），10 μL 2×Taq PCR Master Mixes（Takara，DaLian China），0.1 μL正向引物（10 μmol?L-1），0.3 μL反向引物（10 μmol?L-1），0.2 μL熒光標(biāo)記（FAM，HEX，ROX或TAMRA）的M13引物（10 μmol?L-1）（中國天津，擎科）和9.4 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，10℃保存（BIO-RAD PCR Thermal Cycler T100，USA）。

1.3.6 熒光毛細(xì)管電泳位點(diǎn)信息檢測 將3對(duì)或4對(duì)熒光SSR引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物合并在一起。然后使用ABI 3730XL DNA測序儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）通過毛細(xì)管電泳分析混合物中片段位置信息，并使用Gene Marker v 2.2.0軟件（Soft Genetics LLC，State College，PA，USA）讀取等位變異具體的片段大小信息。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Power Marker 3.25[16]和GenAlEx 6.51[17-18]軟件計(jì)算包括主要等位基因頻率（MAF）、等位基因數(shù)量（Na）、基因多樣性（GD）、雜合性（He）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、多態(tài)信息含量（PIC）等遺傳多樣性指標(biāo)。使用Power Marker 3.25計(jì)算各資源間的Nei’s遺傳距離，隨后基于UPGMA的方法在FigTree v1.4.3中構(gòu)建聚類樹。使用Structure 2.3.3[19]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的分析。通過GenAlEx 6.51計(jì)算種群間的遺傳分化固定指數(shù)（Fst）、基因流（Nm）、主坐標(biāo)分析（PCoA）和分子變異分析（AMOVA），利用這些數(shù)據(jù)評(píng)估各種群間的遺傳分化和遺傳變異特征。

2 結(jié)果

2.1 高質(zhì)量SSR引物的篩選

本試驗(yàn)選取不同產(chǎn)區(qū)的12個(gè)板栗品種作為篩選階段的材料，以分布于不同板栗連鎖群的330對(duì)SSR引物為基數(shù)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選高質(zhì)量和高多態(tài)的SSR引物作為后續(xù)進(jìn)行遺傳多樣性分析的備選引物。以條帶清晰、位點(diǎn)多態(tài)性高為原則，最終在330對(duì)引物中篩選出12對(duì)高多態(tài)引物。12對(duì)SSR引物分別是CmSI0396、CmSI0561、CmSI0614、CmSI0658、CmSI0702、CmSI0742、CmSI0800、CmSI0853、CmSI0871、CmSI0883、CmSI0922、CmSI0930（表2），圖1是引物CmSI0561和CmSI0614的位點(diǎn)信息圖例，通過分型統(tǒng)計(jì)可知CmSI0561在12個(gè)板栗品種中有6個(gè)不同的位點(diǎn)組合，CmSI0614有7個(gè)不同的位點(diǎn)組合，表現(xiàn)出高多態(tài)性。這些多態(tài)的SSR引物進(jìn)一步用高分辨率的毛細(xì)管電泳進(jìn)行位點(diǎn)檢測。

2.2 SSR分子標(biāo)記的遺傳多樣性

選取12對(duì)高質(zhì)量SSR標(biāo)記，采用熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)96份栗屬植物資源進(jìn)行分析（表3）。相比凝膠電泳檢測，毛細(xì)管電泳檢測的分辨率能達(dá)到1 bp，更能準(zhǔn)確地讀取位點(diǎn)信息（圖2），為了檢驗(yàn)毛細(xì)管電泳檢測的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)先用聚丙烯酰胺凝膠電泳與毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測對(duì)比。以引物CmSI0614為例（圖2），毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果與凝膠電泳檢測位點(diǎn)一致，并且能準(zhǔn)確地讀取具體的片段大小。

圖1 高多態(tài)引物CmSI0561和CmSI0614在12個(gè)板栗品種中的位點(diǎn)信息

表2 12對(duì)高質(zhì)量SSR標(biāo)記的信息表

圖2 聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染結(jié)果和毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果對(duì)比

利用毛細(xì)管電泳檢測共獲得129個(gè)等位變異，每個(gè)標(biāo)記平均10.750位點(diǎn)變異。等位變異的大小范圍從標(biāo)記CmSI0742的137 bp到標(biāo)記CmSI0922的351 bp。位點(diǎn)多樣性（GD）變幅為0.656（CmSI0396）—0.877（CmSI0930），平均為0.800；觀察雜合度（Ho）變幅為0.329（CmSI0742）—0.769（CmSI0702），平均為0.615；期望雜合度（He）變幅為0.489（CmSI0742）—0.789（CmSI0922），平均為0.672；多態(tài)信息含量（PIC）變幅為0.586（CmSI0396）—0.868（CmSI0930），平均為0.774；單個(gè)分子標(biāo)記層面的Fst指數(shù)變幅為0.066（CmSI0853）—0.304（CmSI0742），平均為0.172。

2.3 栗屬植物種群間的遺傳多樣性

分析不同栗屬植物種群間的遺傳多樣性數(shù)據(jù)（表4），可知茅栗種群的觀察位點(diǎn)數(shù)（Na）、有效等位變異（Ne）和Shannon多樣性指數(shù)均為最高，其次是板栗種群，最低的是日本栗種群；在雜合度方面，茅栗也表現(xiàn)出較高的雜合性。茅栗種群有最為豐富的遺傳多樣性，這可能與其資源類型有著密切關(guān)系，茅栗是未開發(fā)的野生種質(zhì)資源，而選用的板栗、錐栗和日本栗為實(shí)生選育的品種或農(nóng)家種質(zhì)資源。

表3 12對(duì)SSR標(biāo)記的關(guān)鍵遺傳數(shù)據(jù)

表4 不同栗屬植物種群間的關(guān)鍵遺傳數(shù)據(jù)

2.4 栗屬種群遺傳分化與變異分布

通過計(jì)算兩兩群體間的Fst固定系數(shù)（表5），可知板栗種群與錐栗種群、茅栗種群間的遺傳分化值在0.05—0.15，種群間存在中等程度的分化，而與日本栗種群間的遺傳分化值為0.165，表現(xiàn)出較大的遺傳分化。錐栗種群與茅栗種群間的遺傳分化值為0.115，群體間存在中等程度的分化，與日本栗種群間的遺傳分化值為0.180，也表現(xiàn)出較大的遺傳分化。茅栗種群與日本栗種群間的遺傳分化值0.108，種群間存在中等程度的分化。該結(jié)果與單個(gè)分子標(biāo)記層面Fst值的結(jié)論較為一致。

為了確定栗屬植物種群間位點(diǎn)的變異總量及在種群間和種群內(nèi)的變異分布，本試驗(yàn)對(duì)4個(gè)種群進(jìn)行了分子方差分析（AMOVA）。結(jié)果表明，變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，占總變異量的73%，種群間的變異占27%。同時(shí)，栗屬植物種群的基因流（Nm）為1.580，大于1，也說明種群間存在著一定的基因交流，由此降低了因遺傳漂變引起的各種群間遺傳分化程度。

表5 兩兩種群間的Fst值

2.5 栗屬植物的群體結(jié)構(gòu)和主坐標(biāo)分析

通過對(duì)96份資源進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析（圖3），結(jié)果表明，當(dāng)K=3時(shí)，Delta K出現(xiàn)明顯峰值，將供試材料劃分為3個(gè)組群（圖4）。其中綠色組群（50份）主要為板栗種群，代表板栗的主要基因庫；藍(lán)色組群（13份），全部為錐栗種群，代表錐栗的主要基因庫；紅色組群（33份），主要為茅栗和日本栗資源，同時(shí)部分資源為種間混合類型。當(dāng)K=4時(shí)，也表現(xiàn)較高的Delta K值，此情況下供試材料中的日本栗資源獨(dú)立出來（圖4），由此可判斷日本栗和茅栗種間具有較近的親緣關(guān)系。

通過對(duì)供試材料進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），可知全部資源可大致劃分為4個(gè)組，主坐標(biāo)（PCo）1和2分別解釋了位點(diǎn)信息數(shù)據(jù)中20.89%和8.76%的變異（圖5）。紅色代表板栗資源，大部分資源位于左上部成為一簇；綠色代表錐栗資源，都位于中下偏左部成為一簇；藍(lán)色代表茅栗資源，大部分資源位于中下偏右部成為一簇；紫色代表日本栗資源，都位于右上部成為一簇。同時(shí)，在PCoA可以觀察到，個(gè)別錐栗資源與板栗資源，個(gè)別茅栗資源與日本栗資源相互摻雜，結(jié)合群體結(jié)構(gòu)分析可知這些資源為種間混合類型。

圖3 供試?yán)鯇僦参锶后w結(jié)構(gòu)分析的Delta K值分布

圖4 供試?yán)鯇僦参锏娜后w結(jié)構(gòu)圖

表6 栗屬植物種群間的AMOVA分析

圖5 供試?yán)鯇僦参锏闹髯鴺?biāo)分析（PCoA)

2.6 不同栗屬資源的聚類

通過對(duì)96份資源進(jìn)行基于UPGMA方法的聚類分析（圖6），結(jié)果表明，全部資源被劃分為4個(gè)類群（Pop1、2、3、4），全部的50份板栗資源聚類在Pop1中；Pop2共計(jì)13份，全部是錐栗資源；Pop3共計(jì)16份資源，主要是茅栗資源；Pop4共計(jì)17份資源，包括全部日本栗資源和3個(gè)茅栗資源。Pop4中3個(gè)茅栗資源與日本栗資源獨(dú)立分開成立一支，結(jié)合群體結(jié)構(gòu)的結(jié)果，可知3個(gè)茅栗資源中有日本栗基因的混入。供試材料的聚類結(jié)果與群體結(jié)構(gòu)分析和主坐標(biāo)分析結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明茅栗與日本栗之間具有較近的親緣關(guān)系。

3 討論

3.1 SSR分子標(biāo)記的篩選及其在栗屬植物遺傳多樣性方面的運(yùn)用

SSR分子標(biāo)記具有穩(wěn)定性、共顯性、可重復(fù)性和多態(tài)性的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種遺傳相關(guān)領(lǐng)域，例如資源鑒定、遺傳圖譜、遺傳多樣性以及核心種質(zhì)的選擇等[20-21]，這些研究的有效性和成功與否很大程度上取決于選用的分子標(biāo)記的質(zhì)量和基因型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性[22-23]。MULLER等[11]報(bào)道了利用24個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)272個(gè)美洲栗個(gè)體進(jìn)行基因分型，共獲得135個(gè)等位變異，平均每對(duì)引物5.6個(gè)。江錫兵等[10]利用17個(gè)SSR分子標(biāo)記在來自10省份的95個(gè)板栗品種共獲得44個(gè)位點(diǎn)變異，平均每對(duì)引物2.6個(gè)，多態(tài)性信息含量（PIC值）平均為0.352。張馨芳等[24]利用21個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)151份板栗資源進(jìn)行檢測，共獲得71個(gè)變異位點(diǎn)，平均每對(duì)引物3.38個(gè)，多態(tài)性信息含量（PIC值）平均約為0.867，有效等位基因數(shù)（Ne）和Shannon多樣性指數(shù)（I）分別為1.498、0.4655。黃武剛等[25]用10對(duì)SSR引物對(duì)69個(gè)野生板栗個(gè)體進(jìn)行分析，共檢測到84個(gè)等位變異，每位點(diǎn)的平均等位變異為8.400個(gè)，平均有效等位基因數(shù)（Ne）、平均期望雜合度（He）、平均多態(tài)性信息含量（PIC值）分別為4.998、0.777和0.739。本研究從330個(gè)SSR標(biāo)記中篩選出12對(duì)高質(zhì)量的引物，在收集的96個(gè)栗屬植物中共獲得129個(gè)等位變異，每對(duì)引物平均有10.750個(gè)位點(diǎn)變異，這是JIANG等[10]研究結(jié)果的近5倍，也高于張馨芳等[24]和黃武剛等[25]的研究結(jié)果。本研究使用12個(gè)SSR標(biāo)記計(jì)算全部資源的觀察雜合度（Ho平均值為0.615，顯示出較高的雜合度，與前人研究結(jié)果一致[26]，板栗的高度雜合特性與其為異花授粉植物密不可分[27-29]。12個(gè)SSR標(biāo)記多態(tài)信息含量（PIC）的平均值為0.774（>0.500），最大值達(dá)到0.868，代表供試材料具有高多態(tài)性。其原因可能是本試驗(yàn)收集了更為廣泛的種間種質(zhì)資源，此外，本試驗(yàn)利用毛細(xì)管電泳檢測技術(shù)進(jìn)行讀取和記錄目的條帶，不僅極大地提高了基因座檢測的準(zhǔn)確性，而且大大克服了凝膠電泳檢測分辨率低的問題。

圖6 供試?yán)鯇僦参锏腢PGMA系統(tǒng)樹譜圖

3.2 中國栗屬植物種間遺傳多樣性的差異

現(xiàn)今中國分布的栗屬植物資源中板栗的栽培面積最大，共有5大品種生態(tài)群，其次是錐栗和日本栗，而具有童期短和矮化特性的茅栗處于待開發(fā)狀態(tài)[2]。栗屬植物作為典型的果樹材料，由于其本身遺傳特征的制約，栗屬植物品種選育仍以實(shí)生選育為主，缺乏優(yōu)質(zhì)高效的品種和抗性良好的砧木種質(zhì)資源。Shannon多樣性指數(shù)（I）結(jié)果表明，茅栗種群最高，且茅栗的遺傳多樣性最高，這一結(jié)果與郎萍等[27]的結(jié)論不一致，其可能的原因有兩個(gè)：其一，樣品的選擇不同，郎萍等選擇的樣品主要集中在長江中下游和西南地區(qū)，本研究中茅栗和板栗樣品的選擇覆蓋度更廣；其二，分子標(biāo)記的技術(shù)不同，郎萍等利用的技術(shù)為同工酶，評(píng)估樣品多樣性的能力有限。本研究利用的技術(shù)是熒光SSR標(biāo)記，其具有更豐富的多態(tài)性，能較好地反映樣品的多樣性。同時(shí)，茅栗是未開發(fā)的野生資源，茅栗資源可能保留著更為豐富的遺傳變異，其巨大的種質(zhì)利用潛力一直被人們所忽視。

在種間遺傳分化方面，可知栗屬植物種間的遺傳分化值在0.077—0.180，種群間存在中等以上程度的分化，尤其板栗種群、錐栗種群與日本栗種群間表現(xiàn)出較大的遺傳分化，這一結(jié)果與主坐標(biāo)分析（PCoA）和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果具有高度一致性。同時(shí)，通過基因流（Nm）和分子方差分析（AMOVA）可知，栗屬植物種群間基因流為1.580，表現(xiàn)出較高頻繁的基因流動(dòng)，但顯著低于張馨芳等[24]（Nm=9.696）及黃武剛等[25]（Nm=2.476）在板栗種內(nèi)利用SSR分子標(biāo)記計(jì)算的基因流，也低于郎萍等[27]（Nm=2.043）在板栗、錐栗和茅栗種間利用同工酶計(jì)算的基因流；栗屬植物種群間的遺傳變異占27%，也顯著高于張馨芳等[24]（4.9%）和黃武剛等[25]（13%）在板栗種內(nèi)居群間的遺傳變異，而低于程麗莉等[30]通過cpSSR計(jì)算的栗屬種間的遺傳變異（33%）。因此，推測栗屬植物作為一種典型的異花授粉植物，種群間在自然條件下具有一定的基因交換，正是這些基因流阻止了各種間的進(jìn)一步分化，栗屬的這種分化特點(diǎn)與WRIGHT[31]的理論相符。

在栗屬植物種間群體遺傳多樣性研究方面，現(xiàn)階段的研究主要集中在板栗或錐栗等單個(gè)種內(nèi)不同地域的群體遺傳多樣性方面[31-34]，而栗屬植物種間群體遺傳多樣性的研究知之甚少。本研究通過群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可知板栗與錐栗，錐栗與茅栗的遺傳背景存在明顯的種間界限，這與韓繼承等[35]研究結(jié)果一致。同時(shí)板栗和錐栗、板栗和茅栗、茅栗和日本栗之間有著廣泛的基因交流，在供試材料中有部分資源為種間混合類型。例如65、71和82號(hào)資源既有茅栗的遺傳背景又有日本栗的遺傳背景，在聚類樹結(jié)構(gòu)中位于茅栗和日本栗亞分支的中間位置。48號(hào)資源‘廣東矮生’同時(shí)含有板栗和茅栗的遺傳背景，在地理分布上，廣東省正處于板栗和茅栗資源的重疊生態(tài)區(qū)；在園藝學(xué)性狀上，其也表現(xiàn)出茅栗樹勢矮小和板栗堅(jiān)果大的性狀特征。綜上可知，栗屬植物種群間的遺傳分化程度在中等以上，部分資源在世代遺傳中繼承了不同祖先種的遺傳信息；在相同生態(tài)區(qū)域的栗屬植物種間存在一定的基因交流，沒有形成完全的生殖隔離。

4 結(jié)論

篩選的12對(duì)SSR引物能夠準(zhǔn)確評(píng)估中國栗屬植物的遺傳多樣性，綜合聚類分析可確定栗屬植物的類群劃分與種間信息高度一致且種間存在一定的基因交換，茅栗與日本栗具有較近的親緣關(guān)系，茅栗遺傳多樣性較高，具有很大的利用潛力。這將為未來栗屬植物種質(zhì)創(chuàng)新提供重要的理論依據(jù)。

[1] 張宇和, 柳鎏, 梁維堅(jiān), 張育明. 中國果樹志, 板栗, 榛子卷. 中國林業(yè)出版社, 2005: 22-27.

ZHANG Y H, LIU L, LIANG W J, ZHANG Y M. China Fruits’ Monograph, Chinese Chestnut: Hazelnut Volume. Beijing: China Forestry Publishing House, 2005: 22-27. (in Chinese)

[2] HUANG H W, DANE F , NORTON J D. Allozyme diversity in Chinese, Seguin and American chestnut (spp.). Theoretical and Applied Genetics, 1994, 88(8): 981-985.

[3] PEREIRALORENZO S, RAMOSCABRER A M. Chestnut, an Ancient Crop with Future. Production Practices and Quality Assessment of Food Crops Volume 1Springer Netherlands, 2004, 2: 105-161.

[4] LANG P, DANE F, KUBISIAK T L. Phylogeny of Castanea (Fagaceae) based on chloroplasttrnT-L-F sequence data. Tree Genetics & Genomes, 2006, 2(3): 132-139.

[5] 魏瀟, 章秋平, 劉寧, 張玉萍, 徐銘, 劉碩, 張玉君, 馬小雪, 劉威生. 不同來源中國李（L.）的多樣性與近緣種關(guān)系. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(3): 568-578.

WEI X, ZHANG Q P, LIU N, ZHANG Y P, XU M, LIU S, ZHANG Y J, MA X X, LIU W S. Genetic diversity of theL. from different sources and their related species. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(3): 568-578. (in Chinese)

[6] 李劍鋒, 張博, 全建章, 王永芳, 張小梅, 趙淵, 袁璽壘, 賈小平, 董志平. 基于SSR標(biāo)記的谷子主要農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)檢測及等位變異分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(24): 4453-4469.

LI J F, ZHANG B, QUAN J Z, WANG Y F, ZHANG X M, ZHAO Y, YUAN X L, JIA X P, DONG Z P. Associated loci detection and elite allelic variations analysis of main agronomic traits in foxtail millet (L.) based on SSR markers. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(24): 4453-4469. (in Chinese)

[7] 石甜甜, 何杰麗, 高志軍, 陳凌, 王海崗, 喬治軍, 王瑞云. 利用EST-SSR評(píng)估糜子資源遺傳差異. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(22): 4100-4109.

SHI T T, HE J L, GAO Z J, CHEN L, WANG H G, QIAO Z J, WANG R Y. Genetic diversity of common millet resources assessed with EST-SSR markers. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(22): 4100-4109.(in Chinese)

[8] GUR-ARIE R, COHEN C J, EITAN Y, SHELEF L, HALLERMAN E M, KASHI Y. Simple sequence repeats in escherichia coli: Abundance, distribution, composition, and polymorphism. Genome Research, 2000, 10(1): 62-71.

[9] INOUE E, NIN L, HARA H, RUAN S A, ANZAI H. Development of simple sequence repeat markers in Chinese chestnut and their characterization in diverse chestnut cultivars.Journal of the American Society for Horticultural Science, 2009, 134(6): 610-617.

[10] JIANG X B, TANG D, GONG B C. Genetic diversity and association analysis of Chinese chestnut (Blume) cultivars based on SSR markers. Brazilian Journal of Botany, 2017, 40: 235-246.

[11] MULLER M, NELSON C.D, GAILING O. Analysis of environment- marker associations in American chestnut. Forests, 2018, 9(11): 695.

[12] KUBISIAK T L, NELSON C D, STATON M E, ZHEBENTYAYAYEVA T, SMITH C, OLUKOLU B A, FANG C, HEBARD F V, ANAGNOSTAKIS S, Wheeler N, SISCO P H, ABBOTT A G, SEDEROFF R R. A transcriptome-based genetic map of Chinese chestnut () and identification of regions of segmental homology with peach (). Tree Genetics & Genomes, 2013, 9(2): 557-571.

[13] 劉國彬, 曹均, 蘭彥平, 王金寶. 明清板栗古樹指紋圖譜的構(gòu)建. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 39(1): 134-139.

LIU G B, CAO J, LAN Y P, WANG J B. Construction of SSR fingerprint on 33 ancient chestnut trees. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis, 2017, 39(1): 134-139. (in Chinese)

[14] 曹慶芹, 徐月, 馮永慶. 板栗基因組DNA不同提取方法的比較. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 23(6): 160-163.

CAO Q Q, XU Y, FENG Y Q. Comparison studies on extracting genomic DNA of chestnut (BL) by different methods. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2007, 23(6):160-163. (in Chinese)

[15] 聶興華, 張卿, 劉陽, 代月星, 曹慶芹, 秦嶺. 板栗SSR標(biāo)記研究中聚丙烯酰胺凝膠銀染顯影體系的優(yōu)化. 北方園藝, 2019(12): 27-33.

NIE X H, ZHANG Q, LIU Y, DAI Y X, CAO Q Q, QIN L. Optimization of PAGE silver-stained system based on SSR markers in the chestnut. Northern Horticulture, 2019(12): 27-33.(in Chinese)

[16] LIU K J, MUSE S V. PowerMarker: An integrated analysis environment for genetic marker analysis. Bioinformatics, 2005, 21(9): 2128-2129.

[17] PEAKALL R, SMOUSE P E. GenAlEx 6.5: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update. Bioinformatics, 2012, 28(19): 2537-2539.

[18] PEAKALL R, SMOUSE P E. GenALEX 6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research. Molecular Ecology Notes, 2006, 6: 288-295.

[19] FALUSH D, STEPHENS M, PRITCHARD J K. Inference of population structure using multi-locus genotype data: Linked loci and correlated allele frequencies.Genetics, 2003, 164: 1567-1587.

[20] TAUTZ D, RENZ M. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nucleic Acids Research, 1984, 12: 4127-4138.

[21] SARDAR S S, PRADHAN K, SHUKLA R P, SARASWAT R, SRIVASTAVA A, JENA S N, DAS A B. In silico mining of EST-SSRs inL. and their utilization for genetic structure and diversity analysis in cultivars/breeding lines in Odisha, India. Molecular Breeding, 2016, 36: 49.

[22] LIU S R, LIU H W, WU A L, HOU Y, AN Y L, WEI C L. Construction of fingerprinting for tea plant () accessions using new genomic SSR markers. Molecular Breeding, 2017, 37: 93.

[23] SELKOE K A, TOONEN R J. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters, 2006, 9: 615-629.

[24] 張馨方, 張樹航, 李穎, 郭燕, 王廣鵬. 基于SSR標(biāo)記的燕山板栗種質(zhì)資源遺傳多樣性分析. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2020, 25(4): 61-71.

ZHANG X F, ZHANG S H, LI Y, GUO Y, WANG G P. Genetic diversity analysis of chestnut germplasm in Yanshan region based on SSR markers. Journal of China Agricultural University, 2020, 25(4): 61-71. (in Chinese)

[25] 黃武剛, 程麗莉, 周志軍, 劉建立. 板栗野生居群遺傳多樣性研究. 果樹學(xué)報(bào), 2010, 27(2): 227-232.

HUANG W G, CHENG L L, ZHOU Z J, LIU J L. SSR analysis on genetic diversity of wild Chinese chestnut populations. Journal of Fruit Science, 2010, 27(2): 227-232. (in Chinese)

[26] XING Y, LIU Y, ZHANG Q, NIE X H, SUN Y M, ZHANG Z Y, LI H C, FANG K F, WANG G P, HUANG H W, BISSELING T, CAO Q Q, QIN L. Hybrid de novo genome assembly of Chinese chestnut ().GigaScience, 2019, 8: 1-7.

[27] 郎萍, 黃宏文. 栗屬中國特有種居群的遺傳多樣性及地域差異. 植物學(xué)報(bào), 1999, 41(6): 651-657.

LANG P, HUANG H W. Genetic diversity and geographic variation in natural populations of the endemicspecies in China. Acta Botanica Sinica, 1999, 41(6): 651-657. (in Chinese)

[28] MOKAY J. Self-sterility in the Chinese chestnut. Proceedings of the American Society for Floret Science, 1942, 41: 156-160.

[29] PAYNE J A, JAYNES R A, KAYS S J. Chinese chestnut production in the United States: practice, problems, and possible solutions. Economic Botany, 1983, 37: 187-200.

[30] 程麗莉, 胡廣隆, 蘇淑釵, 黃武剛. 板栗及其近緣種葉綠體SSR遺傳多樣性分析. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 30(2): 145-149.

CHENG L L, HU G L, SU S C, HUANG W G. Diversity of cultivated chestnuts and it’s close relative species using chloroplast SSRs. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2015, 30(2): 145-149. (in Chinese)

[31] WRIGHT S. Evolution in Mendelian populations. Genetics, 1931, 16: 97.

[32] 田華, 康明, 李麗, 姚小洪, 黃宏文. 中國板栗自然居群微衛(wèi)星(SSR)遺傳多樣性. 生物多樣性, 2009, 17(3): 296-302.

TIAN H, KANG M, LI L, YAO X H, HUANG H W. Genetic diversity in natural populations ofinferred from nuclear SSR markers. Biodiversity Science, 2009, 17(3): 296-302. (in Chinese)

[33] 李穎林. 錐栗野生和栽培群體遺傳多樣性的SSR分析[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2019.

LI Y L. Genetic diversity of wild and cultivated populations revealed by SSR markers in[D]Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2019. (in Chinese)

[34] TANAKA T, YAMAMOTO T, SUZUKI M. Genetic diversity ofin Northern Japan assessed by SSR markers. Breeding Science, 2005, 55(3): 271-277.

[35] 韓繼成, 劉慶香, 王廣鵬, 孔德軍, 張新忠. 栗屬植物遺傳多樣性研究進(jìn)展. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2006, 21(z2): 129-132.

HAN J C, LIU Q X, WANG G P, KONG D J, ZHANG X Z. The progress of the genetic diversity studies on(Tourn.) L. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2006, 21(z2): 129-132. (in Chinese)

Genetic Diversity Evaluation ofin China Based on Fluorescently Labeled SSR

NIE XingHua1，ZHENG RuiJie2，ZHAO YongLian3，CAO QingQin1,4，QIN Ling1,4，XING Yu

1College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206;2Liaoning Economic Forest Research Institute, Dalian 116000, Liaoning;3Chestnut Technology Experiment and Extension Station of Huairou District, Beijing 102206;4Advanced Innovation Center for Forest Molecular Design and Breeding, Beijing 102206

【】The characteristics of genetic diversity, relationships and population structure ofplants in China were analyzed with SSR molecular markers, so as to provide a theoretical basis for variety improvement, germplasm innovation and utilization ofplants. 【】Firstly, 330 SSR molecular markers were screened among 12 chestnut cultivars from different production areas, and 12 pairs of high-quality SSR primers were obtained from them. Secondly, 96 accessions offrom 4 species were detected by high resolution capillary electrophoresis. Finally, Power Marker 3.25, GenAlEx 6.51, FigTree v1.4.3 and Structure 2.3.3 were used to analyze the population genetic diversity of all accessions. 【】A total of 129 alleles were acquired from 96 accessions, and the average variation of each marker was 10.750. The gene diversity (GD) ranged from 0.656 (CmSI0396) to 0.877 (CmSI0930) with an average of 0.800; the observed heterozygosity (Ho) ranged from 0.329 (CmSI0742) to 0.769 (CmSI0702) with an average of 0.615; the expected of heterozygosity (He) ranged from 0.489 (CmSI0742) to 0.789 (CmSI0922), with an average of 0.672; the polymorphic information content (PIC) ranged from 0.586 (CmSI0396) to 0.868 (CmSI0930), with an average of 0.774. Among differentspecies, in terms of number of alleles (Na), number of effective alleles (Ne) and Shannon diversity index,had the highest genetic diversity, followed by, andwas the lowest. According to pairwise population Fst values, the genetic differentiation value ofspecies was 0.077-0.180, showing moderate to high differentiation among the species. Compared with, bothandexhibit relatively high genetic differentiation with Fst values of 0.165 and 0.180, respectively. At the same time, the gene flow (Nm) of theplants was 1.580＞1, suggesting frequent gene exchange amongplants, and which therefore reduced the degree of genetic differentiation among the species caused by genetic drift. The results of analysis of molecular variance (AMOVA) showed that the variation mainly occurred within populations, accounting for 73% of the total variation, and the variation among populations made up 27%. The results of UPGMA cluster analysis, principal coordinate analysis and population genetic structure were consistent, and the genetic background of each accessions had obvious inter-species boundaries. Some accessions inherited the genetic information of different ancestor species in generational inheritance. For example, accession 65, 71 and 82 are mixed types, which contain the genetic background ofand, but there is geographic isolation between the two species.plants in the same ecological region existed extensive gene exchange, and there were no complete reproductive isolation. Accession 48 (‘Guangdongaisheng’) had the genetic background of bothand. In terms of geographical distribution, the native place of this accession was in the overlapping ecological area ofand. 【】The 12 pairs of SSR primers screened could accurately assess the genetic diversity ofplants in China. Comprehensive cluster analysis could confirm that the classification ofplants was highly consistent with the inter-species information and there was a certain amount of gene exchange between species.

SSR;; cluster analysis; population genetic structure; population genetic differentiation

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.013

2020-07-02；

2020-09-15

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000605）、國家自然科學(xué)基金（31870671）、北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（IDHT20180509）

聶興華，Tel：18813011218；E-mail：niexinghuabua@163.com。通信作者鄭瑞杰，Tel：13909844840；E-mail：zhengruijie2006@163.com。通信作者邢宇，Tel：13811529713；E-mail：xingyubua@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）