nuoB對莓實假單胞菌生理特性及在冷鮮雞肉中致腐能力的影響

王光宇，李晴，唐文倩，王虎虎，徐幸蓮，邱偉芬

對莓實假單胞菌生理特性及在冷鮮雞肉中致腐能力的影響

1南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095

【】研究對莓實假單胞菌菌體特性及其對冷鮮雞肉致腐能力的影響，為揭示介導(dǎo)的冷鮮雞肉腐敗機(jī)制，開發(fā)新型保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。通過構(gòu)建插入失活突變株，對比野生株和突變株在體外培養(yǎng)條件下的生長曲線、聚集性、泳動性和生物被膜形成能力；以及原位培養(yǎng)條件對冷鮮雞肉的致腐特征，包括菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）含量、pH和感官評分，探討對莓實假單胞菌生理特性和致腐作用的影響。體外培養(yǎng)條件下，并未影響莓實假單胞菌的生長能力、聚集性和swarming泳動性，但突變株的swimming泳動性和生物被膜形成能力在培養(yǎng)過程中顯著下降。原位條件下，對冷鮮雞肉致腐能力的評估發(fā)現(xiàn)兩組樣品菌落總數(shù)差異不顯著，均達(dá)到了10 lg CFU·g-1；突變株組在冷鮮雞肉儲藏期間TVBN均顯著低于野生株組，在第4天時才超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量15 mg/100 g，培養(yǎng)末期的最大值約為野生株組的1/2；培養(yǎng)前2 d所有樣品的pH均處于正常范圍內(nèi)，突變株組的pH從培養(yǎng)第5天開始顯著低于野生株組；感官評價結(jié)果顯示培養(yǎng)第4天時的兩組樣品均出現(xiàn)了黏液和異味，被判定為腐敗，但突變株組樣品稍弱于野生株組。的破壞沒有影響莓實假單胞菌的生長能力，但抑制了菌株的泳動性、生物被膜形成和對冷鮮雞肉的致腐能力。

莓實假單胞菌；基因；菌體特性；腐??；冷鮮雞肉

0 引言

【研究意義】微生物活動引起的肉品腐敗導(dǎo)致大量的經(jīng)濟(jì)損失和食物浪費[1]。雖然低溫可以有效控制部分嗜溫性腐敗菌的生長，但部分耐冷菌和嗜冷菌仍可以大量繁殖，從而導(dǎo)致肉的腐敗[2]。假單胞菌屬（spp.）是有氧條件下儲存冷鮮肉中的優(yōu)勢腐敗菌屬，而莓實假單胞菌（）是其中最常見的一種，其在肉中的污染比例高達(dá)56.7%—79.0%[3-4]。該菌能在2—35℃下的肉中生長，并且進(jìn)行活躍的代謝活動，分解糖、蛋白和脂肪等物質(zhì)，導(dǎo)致肉品出現(xiàn)質(zhì)構(gòu)軟化、變色、產(chǎn)黏和異味等腐敗現(xiàn)象。因此，探明的潛在作用機(jī)制是有效控制冷鮮肉腐敗的前提，對保障食品衛(wèi)生與安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】冷鮮肉為提供了一個特別合適的生長環(huán)境，使該菌成為冷鮮肉中豐度最大的種群。除了與肉品基質(zhì)的營養(yǎng)成分組成有關(guān)外，的代謝活動也起到了很大的作用[5]。研究表明，可以通過胞外聚合物的作用抑制其他種屬細(xì)菌的生長，使其成為冷鮮肉中優(yōu)勢腐敗菌的同時，在肉表面形成大塊菌落和黏液[6]。同時，分解肉中的肽和氨基酸還可能會產(chǎn)生多種揮發(fā)性化合物[7]，進(jìn)而導(dǎo)致異味的產(chǎn)生。但肉品腐敗是一個非常復(fù)雜的過程，目前很難完全將腐敗特征和腐敗菌的代謝活動對應(yīng)起來?，F(xiàn)有的研究多集中在肉中腐敗菌的種類數(shù)量與肉品質(zhì)指標(biāo)之間的關(guān)系，關(guān)于腐敗菌特定基因和腐敗相關(guān)活動的信息尚不明確。筆者研究團(tuán)隊前期從腐敗冷鮮雞肉中分離到一株具有較強(qiáng)致腐能力的NMC25，氣調(diào)包裝環(huán)境中該菌的致腐能力受到抑制。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示細(xì)菌呼吸鏈的在氣調(diào)環(huán)境中相對于有氧環(huán)境顯著下調(diào)，推測可能參與了細(xì)菌的致腐行為[8]。編碼的NuoB亞基是構(gòu)成細(xì)菌呼吸鏈中復(fù)合體I（complex I，又稱為NADH脫氫酶）的重要成員[9]。研究表明細(xì)菌體內(nèi)NADH脫氫酶片段的組裝至少需要的存在[10-11]。而通過插入打斷法破壞后，菌體內(nèi)無法檢測到復(fù)合體I活性，且不會出現(xiàn)強(qiáng)烈的極性效應(yīng)[12]。因此，的功能與復(fù)合體I密切相關(guān)。復(fù)合體I是大多數(shù)線粒體和細(xì)菌呼吸鏈中的第一個酶，能夠催化電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生質(zhì)子驅(qū)動力，對保持分解代謝和能量守恒之間的平衡及一些必要的代謝過程起到了重要作用[13]。目前已經(jīng)有很多研究集中于這種酶在線粒體呼吸鏈中的核心作用上[14-18]。相對而言，人們對它在細(xì)菌能量生活方式中所起到的作用知之甚少。細(xì)菌的呼吸鏈和產(chǎn)能方式不同于真核生物，細(xì)菌復(fù)合體I由14個不同的蛋白質(zhì)亞基（NuoA到NuoN）組成。近年來，X-射線晶體學(xué)[19]和電鏡[20]等技術(shù)的使用已經(jīng)解析了細(xì)菌復(fù)合體I的結(jié)構(gòu)并擴(kuò)展了對其機(jī)制的理解，同時有證據(jù)表明，復(fù)合體I在細(xì)菌一系列的生長和代謝過程中起重要作用，并且在不同的細(xì)菌群體中起到的作用不同[21-24]，這些都有可能影響細(xì)菌對冷鮮雞肉的腐敗進(jìn)程?！颈狙芯壳腥朦c】綜上所述，受到污染的冷鮮雞肉，在儲藏過程中粘附于表面的菌體會迅速生長繁殖，同時細(xì)菌的代謝活動會導(dǎo)致肉品質(zhì)構(gòu)出現(xiàn)劣變、發(fā)黏和異味等現(xiàn)象。根據(jù)前期研究推測可能通過影響復(fù)合體I的功能進(jìn)而影響細(xì)菌的生長和代謝過程，但目前尚缺乏該基因如何影響細(xì)菌對冷鮮雞肉的致腐能力的系統(tǒng)和深入研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以前期分離到的強(qiáng)致腐NMC25為研究對象，通過構(gòu)建NMC25的插入失活突變株，分析野生株與突變株的生物學(xué)特性差異，并評價原位培養(yǎng)條件下冷鮮雞肉的腐敗特征變化，探討呼吸鏈中對致腐效應(yīng)的影響，為揭示冷鮮雞肉的腐敗規(guī)律，開發(fā)新型貯藏保鮮技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2018—2020年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心和南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院國家重點實驗室進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

NMC25菌株分離自腐敗的冷鮮雞肉，通過16S rRNA測序及種特異性基因PCR鑒定為[25]；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購于北京陸橋技術(shù)有限公司；冷鮮雞大胸購于南京市蘇果超市；本研究引物合成和序列測序均由上海生工生物工程有限公司完成，所用引物如表1所示。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌鍋（Hirayama，日本）；BCM-生化培養(yǎng)箱（STIK，美國）；Thermal Cycler PCR儀1600A超凈工作臺（AIRTECH，蘇州）；B1-150a（Applied Biosystems，美國）；DYCP-32B 型瓊脂糖水平電泳儀（六一，北京）；Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)（Bio Rad，美國）；Gene Pulser XcellTM電穿孔儀（Bio Rad，美國）；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國）；Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀（FOSS，丹麥）；PL202-L天平、FE20臺式pH計（Mettler Toledo，瑞士）。

表1 本研究中所用的引物

下劃線代表限制性內(nèi)切酶酶切位點

Underline sequences are cleavage sites of restriction enzyme

1.3 方法

1.3.1 Δ突變株的構(gòu)建 參考SCHNEIDER等[12]的方法構(gòu)建Δ插入失活突變株（圖1）。以NMC25基因組為模板，以引物nuoB-F/nuoB-R對包含nuoB在內(nèi)的同源臂進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以pKD4質(zhì)粒為模板，利用引物Kpn-Kn-F/Kpn-Kn-R擴(kuò)增卡那霉素抗性基因，利用序列中限制性酶切位點I將卡那霉素片段插入同源臂擴(kuò)增片段并連接到載體pCVD442上，獲得自殺質(zhì)粒pCVD442-Δ。將其電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌β2155獲得供體菌β2155/pCVD442- Δ。供體菌與NMC25通過結(jié)合試驗，利用卡那霉素抗性篩選得到插入失活突變株NMC25 Δ（簡稱為Δ）。利用引物nuoB-outF/nuoB-outR對構(gòu)建突變株進(jìn)行PCR鑒定，內(nèi)部插入打斷的陽性克隆片段大小約為3 260 bp，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定，Δ突變株構(gòu)建完成。

圖1 pCVD442質(zhì)粒圖譜（a）和ΔnuoB突變株構(gòu)建示意圖（b）

1.3.2 生長曲線 將NMC25與Δ突變株接種于TSB中，在28℃下震搖培養(yǎng)至穩(wěn)定期，取菌液待用。進(jìn)行生長曲線測定時，將上述菌液進(jìn)行梯度稀釋，接種至20 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中，使菌懸液濃度約為4 lg CFU·mL-1。將菌液在28℃條件下振搖培養(yǎng)16 h，每隔2 h取菌液進(jìn)行梯度稀釋，在合適的稀釋度下取0.1 mL菌液涂布于TSA平板上，平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)，根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果繪制生長曲線。

1.3.3 菌株表面特性 菌株聚集性測定參考XU等[26]的方法，分別取5 mL NMC25與Δ穩(wěn)定期菌液，8 000×g離心5 min后用PBS溶液重懸，測定初始OD600值（A0）。隨后將菌懸液置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置6 h，測定最終OD600值（A1）。菌體的聚集性（%）使用以下公式計算：（A0-A1）/A0×100。

菌株的swarming和swimming泳動性采用軟瓊脂平板法測定[27-28]。swarming平板的配方為LB 25 g?L-1、葡萄糖0.5 g?L-1和瓊脂粉0.5%；swimming平板的配方為胰蛋白胨10 g?L-1、氯化鈉5 g?L-1、葡萄糖2.55 g?L-1和瓊脂粉0.3%。取兩株菌穩(wěn)定期菌液3 μL分別接種至平板的中心位置，室溫下放置20 min使培養(yǎng)基充分吸收菌液。將平板置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，每隔24 h取出，使用游標(biāo)卡尺測定菌株擴(kuò)散圈的直徑大小。

1.3.4 生物被膜生成能力 菌株生物被膜形成能力的測定采用結(jié)晶紫染色法[29]。無菌條件下取200 μL穩(wěn)定期菌液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，不接種的TSB作為空白對照。分別在12、24、36和48 h取出培養(yǎng)板棄掉孔中菌液，用無菌水洗滌3次，室溫下干燥45 min后每個孔中加入200 μL 0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min，棄去染液后用無菌水洗滌3次，隨后使用200 μL 95%的乙醇溶液洗脫30 min，最后將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中，在570 nm下測定吸光值。

1.3.5 原位培養(yǎng)條件下致腐能力評價 在原位培養(yǎng)條件下評價NMC25和Δ對冷鮮雞肉的致腐能力差異。將冷鮮雞胸肉切成10 g左右切片并送至南京航宇輻照技術(shù)有限公司進(jìn)行輻照滅菌（6 kGy）。將NMC25和Δ于TSB中培養(yǎng)至對數(shù)期，菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋后接種到雞胸肉切片上，使肉表面細(xì)菌數(shù)量最終達(dá)到3 lg CFU·g-1。未接種的雞胸肉作為對照。所有樣品在8℃下儲藏7 d，從第2天開始每天取樣進(jìn)行菌落總數(shù)、揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）、pH測定和感官評價。

樣品菌落總數(shù)測定，將樣品無菌條件下轉(zhuǎn)移到含有90 mL生理鹽水的均質(zhì)袋中均質(zhì)，取均質(zhì)液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度取0.1 mL涂布于TSA平板上，平板倒置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行計數(shù)。

樣品TVBN含量的測定參照GB 5009.228-2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[30]進(jìn)行并稍做修改。將10 g樣品剪碎后加入100 mL去離子水，室溫下振蕩浸提30 min后過濾，取濾液5 mL加入5 mL氧化鎂（10 g?L-1）懸濁液，使用凱氏定氮儀測定。

樣品pH的測定參照KANG等[31]的方法，將10 g樣品與40 mL預(yù)冷的去離子水混合，在15 000 ×條件下勻漿10 s，使用pH計測定勻漿液的pH。

樣品的感官評價參照ZHANG等[32]的方法并稍作修改，由經(jīng)過培訓(xùn)的5名實驗室研究生組成評定小組，依據(jù)GB 2707-2016《鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》標(biāo)準(zhǔn)中的感官要求，對樣品整體可接受性進(jìn)行評分。評分等級為1—9分，其中：9分為極好，8分為很好，7分為可接受，6分為可接受與不可接受之間，5分為輕度無法接受，4分為中度無法接受，3分為非常無法接受，2分為極度不能接受，1分為極差。當(dāng)評分低于6時則視為樣品已腐敗。

1.3.6 統(tǒng)計分析 除生物被膜生成能力及菌體表面特性試驗以外，所有試驗均重復(fù)3次；生物被膜測定與表面特性試驗重復(fù)6次，數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的形式表示。所得數(shù)據(jù)使用SPSS 22進(jìn)行方差分析和T檢驗。采用Duncan’s multiple range test進(jìn)行顯著性（＜0.05）分析，用GraphPad Prism 7.0軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 生長曲線

NMC25與Δ的生長情況如圖2所示。在振蕩培養(yǎng)條件下，前期菌株生長較慢，4 h后開始迅速生長，并在12 h時細(xì)菌數(shù)量達(dá)到8 lg CFU·mL-1。在整個培養(yǎng)過程中，突變株的生長能力與野生株并無顯著差異，說明體外培養(yǎng)時突變株的生長能力并未受到影響。

2.2 菌體表面特性

菌體表面特性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過28℃下6 h孵育，野生株聚集性大小為23.28%，突變株的聚集性大小為23.75%，差異不顯著。說明并未影響NMC25的聚集性。野生株和突變株的swarming泳動能力在24 h分別為5.28和5.32 mm，到96 h時分別達(dá)到9.09和8.87 mm（圖3-a），均表現(xiàn)為隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大，且兩者之間差異不顯著。兩株菌的swimming泳動性同樣表現(xiàn)為隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸增大（圖3-b），24和48 h時兩者泳動能力差異并不顯著，但在72和96 h，突變株的泳動性分別顯著低于野生株。表明僅影響了細(xì)菌的swimming泳動性，并不影響swarming泳動性。

圖2 P. fragi NMC25與ΔnuoB突變株生長曲線

2.3 生物被膜形成

NMC25與Δ的生物被膜形成能力如圖4所示。由圖可知，在12 h時兩株菌形成的生物被膜最多，隨著時間的延長，生成的生物被膜逐漸減少。突變株的生物被膜形成量在12 h時與野生株之間無顯著差異，但12 h以后顯著低于野生株，說明Δ突變株的生物被膜形成能力受到了影響。

*和**分別表明在同一培養(yǎng)時間差異顯著（P<0.05）和極顯著（P<0.01）。下同

圖4 P. fragi NMC25與ΔnuoB突變株的生物被膜形成能力

2.4 原位培養(yǎng)條件下致腐能力評估

經(jīng)過2 d的培養(yǎng)，兩組雞肉切片中的菌落總數(shù)都達(dá)到了6 lg CFU·g-1，最終在第7天達(dá)到10 lg CFU·g-1。整個培養(yǎng)過程中，兩組雞肉切片的菌落總數(shù)均無顯著差異，說明突變株在雞肉上的生長能力沒有發(fā)生較大變化。對照組的菌落總數(shù)在7 d內(nèi)一直為0，說明輻照能有效殺死肉中存在的微生物（圖5）。

圖5 冷藏雞肉儲藏期間的微生物變化

原位培養(yǎng)條件下，兩株菌所污染樣品中的TVBN變化如圖6所示。所有樣品初始的TVBN值約為8 mg/100g。前3 d兩組樣品的TVBN值增長緩慢，在這期間突變株污染樣品TVBN值均未超過15 mg/100g，但野生株污染樣品在第2天就已經(jīng)超過了15 mg/100 g。隨后兩組樣品增長迅速，第7天時，野生株組的TVBN值達(dá)到99.68 mg/100g，而突變株組僅為61.04 mg/100g。從第2天開始，突變株組的TVBN值一直顯著低于野生株組，說明雞肉被突變株污染后，產(chǎn)TVBN能力大大降低。在整個培養(yǎng)過程中，對照組的TVBN值較為平穩(wěn)，始終沒有超過15 mg/100g。

***表示在0.001水平上差異顯著（P<0.001）。下同

兩株菌所污染樣品的pH變化如圖7所示。樣品的初始pH約為5.8，前2 d所有樣品的pH均處于正常范圍，2 d之后開始迅速增加。從第5天開始，突變株組的pH顯著低于野生株組，在第7天時野生株組pH達(dá)到8.2左右，而突變株組pH僅約為7.7。對照組中pH變化較為平穩(wěn)，一直處于5.7—6.2。

原位培養(yǎng)下兩株菌所污染樣品的感官變化如圖8所示。前2 d所有的處理組樣品感官評分都較好，隨時間延長，感官評分逐漸降低。從第4天開始，NMC25和Δ均產(chǎn)生了肉眼可見的黏液和異味（圖8-b），均在4 d時被判定為腐敗。但處理組間的外觀和氣味存在一定差異，突變株組樣品產(chǎn)生的黏液和氣味均稍弱于野生株組。對照組在整個培養(yǎng)期間的色澤、氣味和狀態(tài)都處于正常水平。

圖7 冷藏雞肉儲藏期間的pH變化

虛線表明樣品已達(dá)到感官拒絕

3 討論

雖然復(fù)合體I在線粒體呼吸鏈中的作用已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，但對于它在細(xì)菌領(lǐng)域的生理作用卻知之甚少。Spero等[13]研究表明，-變形菌綱中的復(fù)合體I屬于兩種類型，對假單胞菌所屬分支的生化代謝途徑進(jìn)行分析，結(jié)果顯示有富馬酸鹽和硝酸還原酶等厭氧呼吸酶和大量行使細(xì)胞功能轉(zhuǎn)運蛋白的富集趨勢，表明它們可以轉(zhuǎn)運和代謝一系列營養(yǎng)物質(zhì)，有利于在不同的環(huán)境中生存。這可能是能夠存在于各種儲藏條件如托盤包裝、氣調(diào)包裝和真空包裝食品中[33-35]的一個重要因素。FLEMMING等[36]的研究證實，的缺失會影響整個復(fù)合體I的組裝和功能，但不影響呼吸鏈的其他組成部分。對于復(fù)合體I功能喪失的細(xì)菌來說，一個主要的生存策略可能是使用其他形式的還原劑（例如還原態(tài)鐵氧化還原蛋白等），這些還原劑可以在隨后的代謝途徑中被重新氧化[13]。因此，可能與細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝相關(guān)，有必要深入探究中的作用方式。

ERHARDT等[10]發(fā)現(xiàn)在LB培養(yǎng)基中，大腸桿菌突變株生長速率低于野生株1.5倍，最大生長數(shù)量約為野生株的一半。而PRUSS[37]發(fā)現(xiàn)在胰蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)時，大腸的突變株在穩(wěn)定期以前生長狀況與野生株類似，進(jìn)入穩(wěn)定期后會弱于野生株，同時無法有效地將NADH氧化為NAD+，高NADH水平抑制了三羧酸循環(huán)中檸檬酸合酶和蘋果酸脫氫酶，導(dǎo)致TCA循環(huán)及相關(guān)的氨基酸利用受到影響。但在碳源充足時，突變株在整個培養(yǎng)周期的生長狀況均與野生株類似。綜上所述，在碳源缺乏的情況下會影響菌株的生長，而隨著碳源的豐富，這種影響會逐漸消失，這與本團(tuán)隊的研究結(jié)果一致。在本團(tuán)隊的前期研究中[38]，使用Bioscreen C微生物全自動生長曲線分析儀測定400 μL靜置培養(yǎng)菌液的生長曲線時發(fā)現(xiàn)突變株生長能力弱于野生株；而本試驗中，在20 mL的TSB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)時，的破壞并未導(dǎo)致突變株的生長缺陷，說明在此過程中，培養(yǎng)環(huán)境為提供了充足的碳源，不會影響菌株的生長。在原位培養(yǎng)試驗中，NMC25與Δ在冷鮮雞肉中的生長能力都很強(qiáng)。GB 16869-2005《鮮、凍禽產(chǎn)品》中規(guī)定，鮮禽產(chǎn)品菌落總數(shù)應(yīng)不超過106CFU·g-1，兩組雞肉樣品在2 d時就已經(jīng)不符合標(biāo)準(zhǔn)。筆者課題組前期對冷鮮雞肉進(jìn)行宏基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腐敗雞肉中的豐度最高。同時DOULGERAKI等[39]和LEBERT等[40]的研究也表明，雖然在鮮肉中初始的數(shù)量會比多，但隨著時間推移，會逐漸增多。所以雞肉也是合適的生長基質(zhì)，并為其提供了足夠的碳源，使突變株的生長不受影響。

肉中的腐敗菌能夠形成生物被膜，使其易粘附在食品接觸表面或食品表面導(dǎo)致交叉污染，對食品安全有較大的潛在危害。本研究結(jié)果顯示，的生物被膜形成在12 h時最高，隨后隨時間的延長逐漸下降。表明12 h內(nèi)，菌體粘附在介質(zhì)表面后通過進(jìn)一步的菌體繁殖和彼此之間的相互作用形成了成熟的生物被膜，12 h之后進(jìn)入主動分散階段，生物被膜結(jié)構(gòu)逐漸瓦解，菌體脫落，生物被膜形成量下降。細(xì)菌生物被膜的形成受到多種因素的影響[41]，目前已證實沙門氏菌（）和單增李斯特菌（）的生物被膜形成與表面特性有關(guān)[42]。而的生物被膜形成能力與表面特性的關(guān)系尚不清楚。此外，菌株的擴(kuò)散及粘附性與其表面特性也密切相關(guān)。細(xì)菌的表面化合物組成能夠調(diào)節(jié)細(xì)菌的聚集能力，并且當(dāng)聚集的菌體達(dá)到一定數(shù)量后可行使一定的生理功能[43]。在本研究中，Δ突變株的聚集性與野生株無顯著差異，因此推測并未影響菌株的表面化合物組成。另外，菌體表面特性試驗還發(fā)現(xiàn)Δ突變株的swimming泳動能力相比野生株顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的經(jīng)過插入打斷后，在0.25%胰蛋白胨瓊脂平板中的泳動能力明顯下降[37]，這與本研究結(jié)果一致。這種泳動性變化可能由于能夠影響鞭毛的合成與發(fā)育，或者導(dǎo)致細(xì)菌無法提供足夠的能量供鞭毛或菌毛運動，使得菌體的泳動性下降。菌體的泳動性還是菌體粘附和生物被膜形成過程中必不可少的因素[44]，參與的鞭毛數(shù)量越多，形成的生物被膜越穩(wěn)定。因此，試驗中發(fā)現(xiàn)12 h以后突變株的生物被膜形成量顯著低于野生株，也可能與菌體泳動性的下降有關(guān)。

TVBN是動物性食品的蛋白質(zhì)或含氮化合物受細(xì)菌和酶的作用分解產(chǎn)生的，是反映肉品新鮮度的重要指標(biāo)，鮮肉中TVBN含量隨其腐敗程度的增加而上升[45]。根據(jù)GB2707-2016《鮮（凍）畜、禽產(chǎn)品》規(guī)定，冷鮮肉中揮發(fā)性鹽基氮含量不得超過15 mg·100 g-1。在本研究中，雖然兩組樣品在前3 d的TVBN增長都比較緩慢，但野生株組在2 d時就已經(jīng)超過標(biāo)準(zhǔn)限量，這與NMC25本身在冷鮮雞肉中具有較強(qiáng)的分解蛋白能力和較快的生長速度有關(guān)。而突變株組在3 d以后TVBN含量才迅速升高，在4 d時超過了標(biāo)準(zhǔn)限量，這表明Δ分解營養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)生含氮揮發(fā)性化合物的能力下降。前期研究中發(fā)現(xiàn)，NMC25主要分解雞肉肌原纖維蛋白中的肌球蛋白和肌動蛋白[46]，的破壞可能會導(dǎo)致分解利用這些蛋白的能力下降。正常雞胸肉的pH范圍是5.7—6.1[47]，動物死后肉的pH是由糖酵解過程中糖原產(chǎn)生的乳酸含量決定的，是影響腐敗微生物生長的重要因素[2]。pH升高會促進(jìn)微生物的生長和對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，加速肉的腐敗[48-49]。此外，多數(shù)假單胞菌的蛋白酶最適pH范圍為6.5— 8.0[50]，在本研究中，NMC25與Δ組的pH變化范圍為5.8—8.2，處于或接近酶的最適pH，這可能是兩株菌均能夠快速生長的原因之一。與TVBN變化不同的是，突變株組的pH在第5天時才顯著低于野生株組，這表明能夠影響冷鮮雞肉的腐敗進(jìn)程；同時也說明在腐敗前期，細(xì)菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮揮發(fā)性物質(zhì)不會對肉的pH產(chǎn)生較大影響。

本研究中，野生株和突變株在導(dǎo)致腐敗時能夠在雞肉上產(chǎn)生異味和大量的黏液。有研究表明，肉在腐敗過程中會改變質(zhì)構(gòu)和pH，這些因素會影響揮發(fā)性化合物向氣態(tài)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而形成異味影響感官評價[1]。產(chǎn)黏是肉中非常常見的腐敗現(xiàn)象，這些黏液能夠保持細(xì)菌的水分，保護(hù)它們在低溫下生長[51]。黏液的產(chǎn)生可能使它們在生存競爭中打敗其他微生物，使自己處于優(yōu)勢地位。此外，本研究中Δ組TVBN含量的超標(biāo)時間與感官評價時達(dá)到感官拒絕的時間一致，但NMC25組不一致，說明僅使用TVBN作為判斷雞肉是否腐敗的標(biāo)志并不準(zhǔn)確；JAFFRES等[52]和JOFFRAUD等[53]的研究也認(rèn)為TVBN并不能很好的指示海產(chǎn)品腐敗，這表明對于食品腐敗的判斷仍需要結(jié)合理化指標(biāo)和感官評價。

4 結(jié)論

當(dāng)呼吸鏈中被破壞后，的生長能力、聚集性和swarming泳動性未出現(xiàn)顯著變化，但swimming泳動性和生物被膜形成量受到抑制，原位培養(yǎng)中雞肉的TVBN、pH、產(chǎn)黏和異味程度均出現(xiàn)不同幅度的下降，表明能夠影響的部分生理特性和對冷鮮雞肉的致腐能力。

[1] CASABURI A, PIOMBINO P, NYCHAS G J, VILLANI F, ERCOLINI D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology, 2015, 45: 83-102.

[2] PELLISSERY A J, VINAYAMOHAN P G, AMALARADJOU M A R, VENKITANARAYANAN K. Spoilage Bacteria and Meat Quality. Meat Quality Analysis. Elsevier, 2020: 307-334.

[3] MOHAREB F, IRIONDO M, DOULGERAKI A I, VAN HOEK A, AARTS H, CAUCHI M, NYCHAS G J E. Identification of meat spoilage gene biomarkers inusing gene profiling. Food Control, 2015, 57: 152-160.

[4] NYCHAS G J E, SKANDAMIS P N, TASSOU C C, KOUTSOUMANIS K P. Meat spoilage during distribution. Meat Science, 2008, 78(1/2): 77-89.

[5] ERCOLINI D, CASABURI A, NASI A, FERROCINO I, DI MONACO R, FERRANTI P, MAURIELLO G, VILLANI F. Different molecular types ofhave the same overall behaviour as meat spoilers. International Journal of Food Microbiology, 2010, 142(1/2): 120-131.

[6] WANG G Y, MA F, WANG H H, XU X L, ZHOU G H. Characterization of extracellular polymeric substances produced byunder air and modified atmosphere packaging. Journal of Food Science, 2017, 82(9): 2151-2157.

[7] CALDERA L, FRANZETTI L V, VAN COILLIE E, DE VOS P, STRAGIER P, DE BLOCK J, HEYNDRICKX M. Identification, enzymatic spoilage characterization and proteolytic activity quantificationofspp. isolated from different foods. Food Microbiology, 2016, 54: 142-153.

[8] WANG G Y, MA F, CHEN X J, HAN Y Q, WANG H H, XU X L, ZHOU G H. Transcriptome analysis of the global response ofNMC25 to modified atmosphere packaging stress. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 1277.

[9] BRANDT U. Energy converting NADH: Quinone oxidoreductase (complex I). Annual Review of Biochemistry, 2006, 75: 69-92.

[10] ERHARDT H, STEIMLE S, MUDERS V, POHL T, WALTER J, FRIEDRICH T. Disruption of individual nuo-genes leads to the formation of partially assembled NADH: Ubiquinone oxidoreductase (complex I) in. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2012, 1817(6): 863-871.

[11] FRIEDRICH T, DEKOVIC D K, BURSCHEL S. Assembly of theNADH: ubiquinone oxidoreductase (respiratory complex I). Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2016, 1857(3): 214-223.

[12] SCHNEIDER D, POHL T, WALTER J, D RNER K, KOHLST DT M, BERGER A, SPEHR V, FRIEDRICH T. Assembly of theNADH: ubiquinone oxidoreductase (complex I). Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2008, 1777(7/8): 735-739.

[13] SPERO M A, AYLWARD F O, CURRIE C R, DONOHUE T J. Phylogenomic analysis and predicted physiological role of the proton-translocating NADH: quinone oxidoreductase (complex I) across bacteria. mBio, 2015, 6(2): e00389-15.

[14] SAZANOV L A. The mechanism of coupling between electron transfer and proton translocation in respiratory complex I. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 2014, 46(4): 247-253.

[15] KUSSMAUL L, HIRST J. The mechanism of superoxide production by NADH: Ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2006, 103(20): 7607-7612.

[16] FUKUI H, MORAES C T. The mitochondrial impairment, oxidative stress and neurodegeneration connection: reality or just an attractive hypothesis. Trends in Neurosciences, 2008, 31(5): 251-256.

[17] RHEIN V, SONG X, WIESNER A, ITTNER L M, BAYSANG G, MEIER F, OZMEN L, BLUETHMANN H, DR SE S, BRANDT U. Amyloid-and tau synergistically impair the oxidative phosphorylation system in triple transgenic Alzheimer’s disease mice. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(47): 20057-20062.

[18] LIN M T, BEAL M F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature, 2006, 443(7113): 787-795.

[19] ZICKERMANN V, WIRTH C, NASIRI H, SIEGMUND K, SCHWALBE H, HUNTE C, BRANDT U. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science, 2015, 347(6217): 44-49.

[20] VINOTHKUMAR K R, ZHU J P, HIRST J. Architecture of mammalian respiratory complex I. Nature, 2014, 515(7525): 80-84.

[21] TICHI M A, MEIJER W G, TABITA F R. Complex I and its involvement in redox homeostasis and carbon and nitrogen metabolism incapsulatus. Journal of Bacteriology, 2001, 183(24): 7285-7294.

[22] WEERAKOON D R, OLSON J W. The Campylobacter jejuni NADH: Ubiquinone oxidoreductase (complex I) utilizes flavodoxin rather than NADH. Journal of Bacteriology, 2008, 190(3): 915-925.

[23] WELTE C, DEPPENMEIER U. Membrane-bound electron transport in. Journal of Bacteriology, 2011, 193(11): 2868-2870.

[24] BATTCHIKOVA N, EISENHUT M, ARO E M. Cyanobacterial NDH-1 complexes: Novel insights and remaining puzzles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2011, 1807(8): 935-944.

[25] WANG G Y, LI M, MA F, WANG H H, XU X L, ZHOU G H. Physicochemical properties ofisolates response to modified atmosphere packaging. FEMS Microbiology Letters, 364(11): fnx106.

[26] XU H, ZOU Y Y, LEE H Y, AHN J. Effect of NaCl on the biofilm formation by foodborne pathogens. Journal of Food Science, 2010, 75(9): M580-M585.

[27] CONG Y G, WANG J, CHEN Z J, XIONG K, XU Q W, HU F Q. Characterization of swarming motility in. FEMS Microbiology Letters, 2011, 317(2): 160-171.

[28] HIDALGO G, CHAN M, TUFENKJI N. Inhibition ofCFT073expression and motility by cranberry materials. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(19): 6852-6857.

[29] 王虎虎. 肉源沙門氏菌生物菌膜的形成及轉(zhuǎn)移規(guī)律研究[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

WANG H H. Biofilm formation of meat-borneand its transferring [D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2014. (in Chinese)

[30] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定: GB 5009.228-2016. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2017.

National Health and Family Planning Commission. National Food Safety Standard Determination of TVBN in foods: GB 5009.228-2016. Beijing: Standards Press of China, 2017. (in Chinese)

[31] KANG Z L, WANG P, XU X L, ZHU C Z, ZOU Y F, LI K, ZHOU G H. Effect of a beating process, as a means of reducing salt content in Chinese-style meatballs (kung-wan): a dynamic rheological and Raman spectroscopy study. Meat Science, 2014, 96(2): 669-674.

[32] ZHANG X X, WANG H H, LI N, LI M, XU X L. High CO2-modified atmosphere packaging for extension of shelf-life of chilled yellow- feather broiler meat: A special breed in Asia. LWT-Food Science and Technology, 2015, 64(2): 1123-1129.

[33] PENNACCHIA C, ERCOLINI D, VILLANI F. Spoilage-related microbiota associated with chilled beef stored in air or vacuum pack. Food Microbiology, 2011, 28(1): 84-93.

[34] ZOTTA T, PARENTE E, IANNIELLO R G, DE FILIPPIS F, RICCIARDI A. Dynamics of bacterial communities and interaction networks in thawed fish fillets during chilled storage in air. International Journal of Food Microbiology, 2019, 293: 102-113.

[35] 張若煜, 董鵬程, 朱立賢, 毛衍偉, 羅欣, 張一敏, 韓明山, 韓廣星. 生鮮肉中假單胞菌致腐機(jī)制的研究進(jìn)展. 食品科學(xué), 2020, 41(17): 291-297.

ZHANG R Y, DONG P C, ZHU L X, MAO Y W, LUO X, ZHANG Y M, HAN M S, HAN G X. Progress in understanding the mechanism by whichspp. causes the spoilage of raw meat. Food Science, 2020, 41(17): 291-297. (in Chinese)

[36] FLEMMING D, HELLWIG P, FRIEDRICH T. Involvement of Tyrosines 114 and 139 of Subunit NuoB in the Proton Pathway around Cluster N2 inNADH: Ubiquinone Oxidoreductase. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(5): 3055-3062.

[37] PRUESS B, NELMS J M, PARK C, WOLFE A J. Mutations in NADH: Ubiquinone oxidoreductase ofaffect growth on mixed amino acids. Journal of Bacteriology, 1994, 176(8): 2143-2150.

[38] 王光宇. 氣調(diào)包裝對冷鮮雞肉中莓實假單胞菌致腐效應(yīng)的抑制機(jī)制[D]. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2018.

WANG G Y. Inhibition mechanisms of MAP against chilled chicken spoilage associated with[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2018. (in Chinese)

[39] DOULGERAKI A I, ERCOLINI D, VILLANI F, NYCHAS G J E. Spoilage microbiota associated to the storage of raw meat in different conditions. International Journal of Food Microbiology, 2012, 157(2): 130-141.

[40] LEBERT I, BEGOT C, LEBERT A. Growth ofandin a meat medium as affected by pH (5.8-7.0), water activity (0.97-1.00) and temperature (7-25℃). International Journal of Food Microbiology, 1998, 39(1/2): 53-60.

[41] 張雯, 卞丹, 阮成旭, 時祥柱, 倪莉. 大黃魚源腐敗菌的黏附特性與生物膜特性分析. 食品科學(xué), 2019, 40(14): 84-90.

ZHANG W, BIAN D, RUAN C X, SHI X Z, NI L. Adhesive properties and biofilm characteristics ofspoilage bacteria. Food Science, 2019, 40(14): 84-90. (in Chinese)

[42] DI BONAVENTURA G, PICCOLOMINI R, PALUDI D, D’ORIO V, VERGARA A, CONTER M, IANIERI A. Influence of temperature on biofilm formation byon various food-contact surfaces: relationship with motility and cell surface hydrophobicity. Journal of Applied Microbiology, 2008, 104(6): 1552-1561.

[43] GRZE?KOWIAK ?, COLLADO M C, SALMINEN S. Evaluation of aggregation abilities between commensal fish bacteria and pathogens. Aquaculture, 2012, 356: 412-414.

[44] KALMOKOFF M, LANTHIER P, TREMBLAY T-L, FOSS M, LAU P C, SANDERS G, AUSTIN J, KELLY J, SZYMANSKI C M. Proteomic analysis of11168 biofilms reveals a role for the motility complex in biofilm formation. Journal of Bacteriology, 2006, 188(12): 4312-4320.

[45] LIU D S, LIANG L, XIA W S, REGENSTEIN J M, ZHOU P. Biochemical and physical changes of grass carp () fillets stored at -3 and 0℃. Food Chemistry, 2013, 140(1/2): 105-114.

[46] WANG G Y, MA F, ZENG L Y, BAI Y, WANG H H, XU X L, ZHOU G H. Modified atmosphere packaging decreasedcell metabolism and extracellular proteolytic activities on meat. Food Microbiology, 2018, 76: 443-449.

[47] BARBUT S, ZHANG L, MARCONE M. Effects of pale, normal, and dark chicken breast meat on microstructure, extractable proteins, and cooking of marinated fillets. Poultry Science, 2005, 84(5): 797-802.

[48] COOMBS C E, HOLMAN B W, FRIEND M A, HOPKINS D L. Long-term red meat preservation using chilled and frozen storage combinations: A review. Meat Science, 2017, 125: 84-94.

[49] ODEYEMI O A, ALEGBELEYE O O, STRATEVA M, STRATEV D. Understanding spoilage microbial community and spoilage mechanisms in foods of animal origin. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2020, 19(2): 311-331.

[50] WANG G Y, WANG H H, HAN Y W, XING T, YE K P, XU X L, ZHOU G H. Evaluation of the spoilage potential of bacteria isolated from chilled chickenand. Food Microbiology, 2017, 63: 139-146.

[51] BJORKROTH J, KORKEALA H. Ropy slime-producingstrains possess a strong competitive ability against a commercial biopreservative. International Journal of Food Microbiology, 1997, 38(2/3): 117-123.

[52] JAFFRES E, LALANNE V, MACE S, CORNET J, CARDINAL M, S ROT T, DOUSSET X, JOFFRAUD J J. Sensory characteristics of spoilage and volatile compounds associated with bacteria isolated from cooked and peeled tropical shrimps using SPME-GC-MS analysis. International Journal of Food Microbiology, 2011, 147(3): 195-202.

[53] JOFFRAUD J J, CARDINAL M, CORNET J, CHASLES J S, LéON S, GIGOUT F, LEROI F. Effect of bacterial interactions on the spoilage of cold-smoked salmon. International Journal of Food Microbiology, 2006, 112(1): 51-61.

Effects ofon Physiological Properties ofand Its Spoilage Potential in Chilled Chicken

1College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety of Jiangsu Province, Nanjing 210023;2College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【】The effects ofon the properties ofand its spoilage activity on chilled chicken were studied in this work,which could provide a theoretical basis for revealing mechanism of-mediated chilled chicken spoilage and developing new preservation technologies. 【】Themutant was constructed by inserting a resistance cartridge to analyze the differences of the growth curve, aggregation, motility, and biofilm formation ability between the wild type and the mutant. The effects on the spoilage characteristics of chilled chicken were studied, including the total viable count, TVBN, pH, and sensory evaluation. This study investigated the influence ofon the physiological properties and spoilage potential of. 【】The results showed thatdid not affect the growth condition, aggregation, and swarming motility of. However, the swimming motility and biofilm formation of the mutant were significantly decreased during the incubation period. Theassessment of the spoilage ability on chilled chicken showed that there was no significant difference in the total viable count between two groups, which both reached to 10 lg CFU·g-1.The TVBN in the mutant group was significantly lower than that in the wild type group during the whole storage period and exceeded the national standard limit of 15 mg/100 g on the 4th day. The maximum value of TVBN in the mutant group at the end of storage was about half of that in the wild type group. The pH values of both samples were within the normal levels in the first 2 days, while the mutant group was significantly lower than that in the wild type group after the 5th day.Sensory evaluation results showed that slime and odor occurred in both groups on day 4, which could be considered as spoilage, but the spoilage extent of mutant group was slightly weaker than the wild type group.【】The destruction ofdid not affect the growth ability of, but inhibited its swimming motility, biofilm formation, and spoilage potential in chilled chicken.

; gene; bacterial property; spoilage; chilled chicken

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.08.015

2020-08-14；

2020-10-14

國家自然科學(xué)基金青年基金（31901759）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-肉雞（CARS-41)

王光宇，E-mail：gywangfood@163.com。通信作者徐幸蓮，E-mail：xlxu@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）