電針環(huán)跳、陽(yáng)陵泉對(duì)CCI大鼠海馬18F-FDG攝入率及GLUT-3表達(dá)的影響

江孟鴻，張亮平，李長(zhǎng)征，王志福，鄭美鳳*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州350122）

神經(jīng)病理性疼痛（簡(jiǎn)稱神經(jīng)痛）是軀體感覺(jué)系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的疼痛［1］。目前研究發(fā)現(xiàn)：在神經(jīng)痛發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，海馬出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)和功能的改變，如體積減小、突觸可塑性和細(xì)胞因子釋放的異常等［2-5］。正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層掃描顯像儀（positron emission tomography，PET）可通過(guò)對(duì)18F-氟代脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）的追蹤，動(dòng)態(tài)觀察海馬的葡萄糖代謝變化。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-3（Glucose transporter 3，GLUT-3）是大腦主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，能有效反映海馬神經(jīng)元的葡萄糖代謝情況［6］?，F(xiàn)代研究表明：取“環(huán)跳”“陽(yáng)陵泉”穴進(jìn)行電針干預(yù)有明確鎮(zhèn)痛作用，但電針鎮(zhèn)痛的中樞葡萄糖代謝機(jī)制有待進(jìn)一步研究［7-9］。本研究通過(guò)建立SD大鼠慢性限制性損傷（chronic constriction injury，CCI）模型，采用Micro PET／CT和免疫組化分別檢測(cè)CCI大鼠海馬18F-FDG攝入率和GLUT-3表達(dá)，探討電針治療神經(jīng)痛的中樞作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)：SYXK（閩）2014-0005。于獨(dú)立通風(fēng)籠內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組各12只。

1.2 主要儀器與試劑 Micro PET／SPECT／CT（荷蘭Milabs公司）；Von-Frey針刺痛覺(jué)測(cè)試套件（美國(guó)North Medical公司）；華佗牌針灸針（0.25 mm×25 mm）、華佗牌電子針療儀（SDZ-V型）購(gòu)于蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；免疫組化一抗GLUT-3抗體、免疫組化二抗HRP標(biāo)記兔抗山羊（美國(guó)Abcam公司）；免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 造模 參考Bennett等推薦的方法［10］制備CCI模型，具體方法如下：術(shù)前將4-0鉻制羊腸線浸泡在0.9%氯化鈉注射液1 h以上；3組大鼠稱重，予戊巴比妥鈉麻醉，剃除右后肢毛發(fā)，75%乙醇消毒并切開(kāi)皮膚，逐層鈍性分離皮下組織及肌肉，暴露坐骨神經(jīng)主干；模型組和電針組大鼠在坐骨神經(jīng)主干中段用4-0鉻制羊腸線松扎四道，最后一道結(jié)扎時(shí)，輕拉線結(jié)使腿部肌肉出現(xiàn)輕微跳動(dòng)，然后逐層縫合，切口覆蓋青霉素粉末以預(yù)防感染。假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，不予結(jié)扎。

1.4 干預(yù)措施 術(shù)后7 d電針組開(kāi)始電針干預(yù)。抓取電針組大鼠，固定于實(shí)驗(yàn)用大鼠固定器，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［11］取右側(cè)“環(huán)跳”“陽(yáng)陵泉”穴，以針灸針常規(guī)刺入15 mm，連接電子針療儀，設(shè)置連續(xù)波，頻率為2 Hz，電流強(qiáng)度為1 mA，每次干預(yù)30 min。同樣抓取和固定假手術(shù)組、模型組大鼠，但不予干預(yù)，每天1次，連續(xù)7 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 機(jī)械痛閾值測(cè)試 術(shù)前及干預(yù)前后采用Von-Frey針刺痛覺(jué)測(cè)試套件檢測(cè)，根據(jù)up-and-down的方法［12］進(jìn)行測(cè)試與計(jì)算大鼠機(jī)械痛閾值。

1.5.218F-FDG攝入率檢測(cè) 干預(yù)前后每組隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行Micro PET／CT掃描。大鼠禁食過(guò)夜后，腹腔注射示蹤劑18F-FDG（劑量約40 MBq）后再放回籠中自由活動(dòng)35 min，然后置于麻醉誘導(dǎo)盒中5 min（5%異氟烷，氣流速度400 mL／min）。取出大鼠以俯臥位用膠布固定于掃描臺(tái)，開(kāi)始掃描并全程維持麻醉（2%異氟烷，氣流速度250 mL／min）。掃描圖像通過(guò)PMOD軟件分析，得出大鼠左側(cè)海馬18F-FDG攝入率。

1.5.3 GLUT-3表達(dá)的測(cè)定 采用免疫組化測(cè)定GLUT-3平均光密度，來(lái)反映GLUT-3的表達(dá)。干預(yù)后各組取剩余的6只大鼠，腹腔麻醉后依次用0.9%氯化鈉溶液（150 mL）和4%多聚甲醛溶液（150 mL）進(jìn)行心內(nèi)灌注；取出大腦，放入4%多聚甲醛再固定后常規(guī)脫水、透明、包埋；切片（5μm）后烤片、脫蠟，浸泡在檸檬酸鈉溶液下使用高壓鍋法進(jìn)行修復(fù)，滴加3%雙氧水溶液于室溫下孵育25 min，PBS清洗后滴加3%BSA于37℃恒溫箱內(nèi)放置30 min，取出切片，甩干后滴加免疫組化一抗GLUT-3抗體（1∶50），放入4℃冰箱孵育過(guò)夜；第二天取出切片，復(fù)溫30 min后滴加免疫組化二抗HRP標(biāo)記兔抗山羊后放入37℃恒溫箱內(nèi)孵育1 h；滴加新鮮配置的DAB溶液進(jìn)行顯色，PBS清洗后用蘇木精復(fù)染，二甲苯脫水透明，封片。光學(xué)顯微鏡下參照《大鼠腦立體定位圖譜》［13］找到左側(cè)海馬所處位置，隨機(jī)選取5個(gè)部位進(jìn)行圖像采集，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖像并得出GLUT-3平均光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，自身前后對(duì)照采用配對(duì)t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。若方差齊，采用LSD法進(jìn)行各組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Game’S-Howell法進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠機(jī)械痛閾值比較 干預(yù)前與假手術(shù)組比較，模型組和電針組大鼠機(jī)械痛閾值均顯著降低（P均＜0.01）；干預(yù)后與模型組比較，電針組大鼠機(jī)械痛閾值顯著升高（P＜0.01）；干預(yù)后與干預(yù)前比較，電針組大鼠機(jī)械痛閾值顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠機(jī)械痛閾值比較（±s）g

表1 3組大鼠機(jī)械痛閾值比較（±s）g

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與干預(yù)前比較，3）P＜0.01。

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2.2 3組大鼠18F-FDG攝入率比較 干預(yù)前與假手術(shù)組比較，模型組和電針組大鼠左側(cè)海馬18F-FDG攝入率顯著下降（P＜0.05）；干預(yù)后與模型組比較，電針組大鼠左側(cè)海馬18F-FDG攝入率顯著上調(diào)（P＜0.05）；與干預(yù)前比較，干預(yù)后電針組大鼠18FFDG攝入率顯著提高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠18F-FDG攝入率比較

2.3 3組大鼠GLUT-3平均光密度比較 干預(yù)后與假手術(shù)組比較，模型組大鼠左側(cè)海馬GLUT-3平均光密度顯著降低（P＜0.01）；干預(yù)后與模型組比較，電針組大鼠左側(cè)海馬GLUT-3平均光密度顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠GLUT-3平均光密度比較

3 討 論

坐骨神經(jīng)痛屬中醫(yī)學(xué)“痛痹”范疇，多因感受風(fēng)寒濕外邪、氣血痹阻經(jīng)脈所致。針灸治療坐骨神經(jīng)痛的一般原則為疏經(jīng)通絡(luò)、活血止痛。本實(shí)驗(yàn)選取“環(huán)跳”穴疏導(dǎo)下肢少陽(yáng)、太陽(yáng)經(jīng)氣，“陽(yáng)陵泉”治療下肢經(jīng)筋病證?，F(xiàn)代研究證明：電針此二穴可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和突觸功能來(lái)提高神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛閾值［14-16］。

18F-FDG攝入率的改變能直觀反映葡萄糖代謝的變化，而GLUT-3的表達(dá)水平與局部葡萄糖利用、神經(jīng)元的功能活動(dòng)密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CCI誘導(dǎo)神經(jīng)痛發(fā)生時(shí)，海馬葡萄糖代謝和GLUT-3平均光密度降低，提示海馬中樞敏化和痛敏反應(yīng)的產(chǎn)生。而電針治療后可上調(diào)神經(jīng)痛大鼠海馬葡萄糖代謝及GLUT-3表達(dá)水平，說(shuō)明電針治療可抑制海馬中樞敏化、減輕痛敏反應(yīng)。