鳙對加壓處理前后藍(lán)藻的消化分析

王媛，劉鵬飛，徐東坡*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江下游漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站，江蘇 無錫 214081； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 漁業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

近20年來，中國長江中下游地區(qū)湖泊水庫的水體富營養(yǎng)化問題日趨嚴(yán)重，水體污染已嚴(yán)重影響了水質(zhì)景觀，威脅了供水安全，甚至制約了社會和國民經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展[1]。2017年《水資源公報》報道了全國117個湖泊營養(yǎng)狀況評價結(jié)果[2]，其中，中營養(yǎng)湖泊占23.1%，富營養(yǎng)湖泊占76.9%。全國1 038座水庫營養(yǎng)狀況評價結(jié)果顯示，貧營養(yǎng)水庫占0.3%，中營養(yǎng)水庫占72.6%，富營養(yǎng)水庫占27.1%。21世紀(jì)以來，隨著經(jīng)濟社會的快速發(fā)展，大量含有氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)的污水排入江河、湖泊、水庫，使得水中以藍(lán)藻為主體的藻類大量繁殖，形成肉眼可見的聚積體，其中以群體微囊藻形成的水華最為典型[3-4]。

藍(lán)藻是原核生物，又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，是最簡單最原始的單細(xì)胞生物。藍(lán)藻細(xì)胞能夠產(chǎn)生莢膜和黏液層，主要由胞外多糖組成，具有黏滯性，從而形成網(wǎng)狀膠群體[5]。藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的氣囊是藍(lán)藻細(xì)胞浮力調(diào)節(jié)機制的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，也是原核生物體中唯一充滿氣體的細(xì)胞器[6]，其主要特征是由剛性、中空蛋白質(zhì)圓柱體組成的氣囊結(jié)構(gòu)。藻細(xì)胞氣囊為藍(lán)藻提供浮力[7]，使其能夠長時間停留于水體表層光照區(qū)，從而快速生長繁殖[8]，但當(dāng)壓力高于臨界壓力值(由氣囊的直徑?jīng)Q定)時會發(fā)生不可逆的破裂[6]。研究表明，常壓下藍(lán)藻氣囊體積占細(xì)胞總體積的28%，經(jīng)0.3～0.5 MPa壓力作用后氣囊逐步減少，經(jīng)0.6～0.7 MPa加壓后已觀察不到明顯的氣囊[9]。

加壓混凝技術(shù)是一種典型的物理處理技術(shù)，其原理是利用外加壓力破壞藍(lán)藻的偽空胞，再投入適當(dāng)比例混凝劑使藍(lán)藻混凝沉淀。裴毅等[10]通過檢測加壓處理過的微藻水體，發(fā)現(xiàn)其葉綠素含量、濁度等均有降低；Nakano等[11]發(fā)現(xiàn)，加壓后不破壞原核細(xì)胞，所以藻毒素不會外溢，不會對水體造成新的污染。但有研究表明，在合適的光照條件下，加壓沉淀后的藍(lán)藻逐步上浮，且光照度越大(500～8 000 lx)，氣囊恢復(fù)越多[9]。而且由于藍(lán)藻細(xì)胞具有較強的上浮特性，需要投加大量的混凝劑才能達(dá)到一定的混凝效果[12-13]，所以僅僅通過加壓混凝的處理方式可能會對水體安全產(chǎn)生一定的威脅性。生物技術(shù)中，以生物操縱技術(shù)應(yīng)用最為廣泛。1975年，Shapiro等[14]首先提出生物操縱理論以用于治理湖泊富營養(yǎng)化，但因淺水湖泊生態(tài)系統(tǒng)組成多樣，間接控藻面臨復(fù)雜的反饋機制，導(dǎo)致治理效果并不理想。21世紀(jì)初，謝平[15]提出的非經(jīng)典生物操縱理論，因其能直接有效地控藻而被應(yīng)用于實踐之中，其中，以鰱Hypophthalmichthysmolitrix、鳙Aristichthysnobilis控藻最為廣泛[16-19]。近年來，鰱、鳙控藻效果一直存在爭議，一些學(xué)者認(rèn)為，鰱、鳙能夠有效消除或減輕藍(lán)藻水華的發(fā)生[19-21]，非經(jīng)典生物操縱理論適用于淺水富營養(yǎng)化湖泊，能夠有效控制藻類數(shù)量[19-20]，武漢東湖的圍隔試驗也證明，鰱、鳙能夠有效預(yù)防微囊藻水華[22]；也有研究者認(rèn)為，鰱、鳙等濾食性魚類受鰓耙間距的限制，放養(yǎng)會導(dǎo)致水體浮游生物小型化[18, 23]和微型藻類激增[18, 24]等生態(tài)問題。而且，“魚類富營養(yǎng)化”(ichthyoeutrophication)現(xiàn)象的出現(xiàn)可能會加速系統(tǒng)中營養(yǎng)物的再生[25]。由此可見，僅僅通過鰱、鳙控藻的效果存在不確定性，不利于生態(tài)漁業(yè)實踐工作的開展。

綜上所述，采取特定方法進(jìn)行藍(lán)藻處理存在各種各樣的弊端。經(jīng)實際采樣觀察發(fā)現(xiàn)，太湖北部湖區(qū)鳙腸道內(nèi)含物中有大量的藍(lán)藻存在，故本試驗中結(jié)合物理和生物處理技術(shù)，并利用加壓破碎技術(shù)將藍(lán)藻做預(yù)處理，基于非經(jīng)典生物操控理論提出的“下行作用”原理，藍(lán)藻經(jīng)鳙濾食后加速了水體中氮、磷轉(zhuǎn)化效率，利用電鏡觀察藍(lán)藻形態(tài)的變化，分析了鳙對加壓破碎前后藍(lán)藻消化的差異，以期探尋更利于生態(tài)保護(hù)的綜合修復(fù)方法，為凈水漁業(yè)和環(huán)境保護(hù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鳙取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心養(yǎng)殖基地，均為當(dāng)年魚種。用于室內(nèi)試驗的魚種在360 L玻璃水族箱(120 cm×50 cm×60 cm)中暫養(yǎng)一周，每日9：00定量投喂取自太湖梅梁灣水域的藍(lán)藻(取自德林海錦園藻水分離站)，17：00吸取多余的糞便。正式試驗前兩天，選擇活力良好、體表潔凈的鳙按不同規(guī)格分別暫養(yǎng)于盛有180 L曝氣自來水的水族箱(60 cm×60 cm×50 cm)中，及時處理糞便，待魚腸排空后，作為試驗用魚。藍(lán)藻經(jīng)鏡檢鑒定，以惠氏微囊藻Microcystiswesenbergii和銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa為主，微囊藻屬的藻類約占99%以上，由無錫德林海環(huán)?？萍脊煞萦邢薰咎峁?。

1.2 方法

1.2.1 電鏡觀察試驗的設(shè)計及樣品采集與處理 電鏡試驗設(shè)置。根據(jù)餌料的不同，試驗分為加壓處理組和未加壓處理組，均在體積為100 L的水族箱(50 cm×50 cm×40 cm)中進(jìn)行，養(yǎng)殖用水為曝氣過夜的自來水。試驗溫度為(25.0±0.5)℃，pH為7.7±0.5，溶解氧質(zhì)量濃度為(8.1±0.3)mg/L，藻液密度為3.1×1010cells/L。加壓處理組，藍(lán)藻經(jīng)德林海藍(lán)藻壓力試驗裝置在0.7 MPa壓力下處理1 min，鳙的體質(zhì)量為(112.4±8.6)g；未加壓處理組，藍(lán)藻為原液，鳙的體質(zhì)量為(115.6±7.5)g。每組6尾魚作為平行，試驗時，8:30開始配制藻液，9:00放入鳙開始正式試驗，攝食4 h后將鳙小心撈出，分別放入曝氣過夜的清水中，每缸一尾，觀察待其開始排糞便后，收集糞便并解剖試驗魚，取其中腸內(nèi)含物備用。

藍(lán)藻原液和加壓處理的藻液分別收集在濾膜上；解剖魚體取中腸內(nèi)含物，經(jīng)PBS緩沖液沖洗而收集；收集兩組鳙所排糞便，將所有樣品放入離心管中并加入適量戊二醛溶液進(jìn)行固定，編號后保存于冰箱(4 ℃)中備用。

電鏡樣品制備步驟：

1)脫水，分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水各15 min，再用體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇脫水3次，每次20 min；

2)置換，采用叔丁醇置換3次，每次30 min，叔丁醇熔點為25.69 ℃；

3)干燥，采用ES-2030型冷凍干燥儀(Hitachi)冷凍干燥，約5 h；

4)噴金，采用E-1010/E離子濺射儀(Hatachi)噴金，厚度10 nm，采用S-3000N型掃描電鏡(Hatachi)觀察并拍照。對比加壓處理前后藍(lán)藻及其被魚類攝食后在中腸和糞便中的形態(tài)差異。

1.2.2 攝食消化試驗的設(shè)計及樣品采集與處理 試驗采用灰分比例法測定消化率，試驗前用0.245 mm篩網(wǎng)過濾藻液，去除明顯雜質(zhì)，鏡檢確定藻類密度，稀釋至加壓前后的藍(lán)藻密度(約4.0×108cells/L)，設(shè)置對比試驗；根據(jù)鳙的不同規(guī)格(81.0 g±2.1 g、103.0 g±3.1 g、130.0 g±3.4 g)將試驗設(shè)置為3組，每組6尾魚作為平行。

試驗于2017年夏季進(jìn)行，期間水質(zhì)維持在溶解氧質(zhì)量濃度為(7.4±0.4)mg/L，溫度為(26.3±0.2)℃，pH為7.7±0.5。試驗于9:00開始，期間用黑布遮光，攝食4 h后將試驗魚撈出，分別放入曝氣過夜的清水中，每缸一尾魚，待其排糞后及時收集糞便，并編號待進(jìn)一步處理。收集的糞便及濃縮的藍(lán)藻藻漿分別放入事先稱量好的坩堝中，65 ℃下烘48 h以上至恒重，干燥器中冷卻后稱其干質(zhì)量并記錄，再在450 ℃下灼燒4 h后稱量其灰分質(zhì)量。消化率(A)計算公式[26]為

A=(F-E)/[(1-E)F]。

其中:F為食物(藍(lán)藻)樣品中的有機質(zhì)量(即干質(zhì)量減灰分質(zhì)量)占食物樣品干質(zhì)量的比；E為糞便樣品中的有機質(zhì)量占糞便樣品干質(zhì)量的比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對不同規(guī)格和不同藻液處理方式下鳙的消化率差異進(jìn)行雙因素方差分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)藻形態(tài)的變化

2.1.1 外觀形態(tài)變化 藍(lán)藻原液和加壓藻液靜置4 h后，發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻原液樣品瓶中藍(lán)藻多漂浮在水面，呈暗綠色；而經(jīng)0.7 MPa壓力處理后，大部分藍(lán)藻細(xì)胞下沉在瓶底，呈亮綠色(圖1)。

圖1 壓力作用前后藍(lán)藻外觀形態(tài)的變化Fig.1 Changes in appearance of cyanobacteria before and after pressure

2.1.2 攝食前藍(lán)藻形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 電鏡觀察顯示：藍(lán)藻未做加壓處理時，藍(lán)藻細(xì)胞間膠質(zhì)連接明顯，邊緣模糊，細(xì)胞圓滑，呈圓形或橢圓形(圖2(a))；而經(jīng)過壓力處理后，藍(lán)藻細(xì)胞間的膠質(zhì)明顯脫離，細(xì)胞多趨向于單個個體，細(xì)胞有一定程度的變形，氣囊破裂，邊緣較為清晰(圖2(b))。

2.1.3 攝食后藍(lán)藻形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 電鏡觀察顯示：藍(lán)藻被鳙消化吸收后，中腸內(nèi)未加壓處理的藍(lán)藻細(xì)胞間膠狀物質(zhì)還未完全消失(圖3(a))，而加壓處理后的藻細(xì)胞已經(jīng)有部分正被消化，細(xì)胞已經(jīng)變形，由圓形或橢圓形變成了不規(guī)則圖形(圖3(b))；糞便內(nèi)未加壓處理的藍(lán)藻細(xì)胞間膠狀物質(zhì)基本消失，少量細(xì)胞已經(jīng)被消化(圖4(a))，而加壓處理的藍(lán)藻細(xì)胞表面凹陷明顯，細(xì)胞壁已經(jīng)破裂，大部分細(xì)胞可能正消化或者即將被消化(圖4(b))。

2.2 鳙對加壓處理前后藍(lán)藻的消化率

在相同的環(huán)境條件下進(jìn)行消化率試驗，雙因素方差分析表明，不同規(guī)格的鳙對加壓處理藍(lán)藻的消化率均高于未加壓處理藍(lán)藻，其中，103.0 g組顯著高于81.0、130.0 g組(P<0.05)；81.0 g的鳙對加壓處理過的藍(lán)藻消化率(63.9%)高于藍(lán)藻原液(61.1%)，103.0 g的鳙對加壓處理過的藍(lán)藻消化率高達(dá)83.2%，對藍(lán)藻原液的消化率約為65.7%，130.0 g的鳙對加壓處理過的藍(lán)藻消化率(50.2%)高于藍(lán)藻原液(46.2%)(圖5)。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖5 不同規(guī)格的鳙對加壓處理前后藍(lán)藻的消化率Fig.5 Digestibility of cyanobacteria before and after pressure treatment by bighead carp with different body mass

3 討論

3.1 攝食過程中加壓處理前后藍(lán)藻的形態(tài)變化

偽空胞的臨界壓力隨水深的變化而發(fā)生改變[27]，太湖屬于淺水湖泊[28]，藍(lán)藻的臨界破裂壓力為0.65～0.72 MPa，有研究表明，銅綠微囊藻的偽空胞具有較高的臨界壓力值，為0.66 MPa[29]。本試驗中采取0.7 MPa的壓力，符合其破碎要求，外觀形態(tài)上，加壓處理后的藻液呈亮綠色，未加壓的藻液呈暗綠色，這是由于加壓后光的投射能力強，散射減弱，散射濁度減小，光的透射能力增強，肉眼能觀察到的光強增加后藻細(xì)胞呈亮綠色[9]。有研究表明，電鏡觀察加壓后(0.6～0.7 MPa)藍(lán)藻的偽空胞、藻細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)并未出現(xiàn)明顯破損，整體結(jié)構(gòu)形態(tài)未造成明顯破壞，細(xì)胞內(nèi)的氣體外逸，偽空胞基本消失，細(xì)胞壁完整，細(xì)胞液未外泄[30]。這表明，加壓前后太湖水華藍(lán)藻的細(xì)胞外形基本未改變，但加壓處理后藍(lán)藻沉降性能得到強化，且細(xì)胞間膠狀物質(zhì)明顯消失。還有研究顯示，微囊藻經(jīng)鰱攝食后只是消化了其表面的黏液膠鞘[31]，鰱、鳙對魚糞的消化率也高于初次消化率[32]。本研究中，電鏡觀察加壓前后的藍(lán)藻細(xì)胞被攝食后的形態(tài)變化，結(jié)果顯示，未加壓的藍(lán)藻細(xì)胞在被鳙攝食后，細(xì)胞間的黏液膠鞘基本消失，少量細(xì)胞破碎，而加壓后的藍(lán)藻細(xì)胞被攝食后，細(xì)胞表面凹陷明顯，大量細(xì)胞被破碎。故可以做出預(yù)測，壓力破碎技術(shù)對于解決大量藍(lán)藻聚集水面有一定效果，且加壓處理后的藍(lán)藻細(xì)胞可能更有利于水生生物的消化吸收。

3.2 鳙對加壓處理前后藍(lán)藻的消化吸收

研究表明，魚類的腸道菌群數(shù)量和組成、消化酶活性分布受到餌料、生存環(huán)境、健康狀態(tài)等[33]多種因素的影響。電鏡觀察試驗和消化試驗結(jié)果均證明，藍(lán)藻能被鳙消化吸收。陳少蓮等[34]研究表明，鳙對微囊藻的消化率為26.1%。雷汶龍[35]研究表明，30 ～ 40 g的鰱對銅綠微囊藻的消化率為30%左右。但本試驗中鳙對液壓藍(lán)藻和藍(lán)藻原液的消化率均較高，其中，103.0 g左右的鳙對加壓處理藍(lán)藻的消化率最高(83.2%)。究其原因，一方面，雷汶龍[35]試驗對象鰱雖然也是濾食性魚類，但鰱、鳙對藻類的吸收會產(chǎn)生一定的差異；另一方面，其采用的是實驗室培養(yǎng)的銅綠微囊藻，而本試驗中所取的是天然水域的水華藍(lán)藻，藻液中所攜帶的多種細(xì)菌在鰱、鳙攝食后可能對魚體產(chǎn)生了刺激作用，腸道中消化酶種類、濃度、活性及分布均可能發(fā)生了變化[36]，對于其具體的消化機理，需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究驗證。此外，有學(xué)者提出魚體不同生長發(fā)育階段與其體內(nèi)的消化酶活性息息相關(guān)[37]。本試驗中設(shè)置了不同規(guī)格的鳙進(jìn)行攝食消化試驗，其中，103 g左右的鳙消化率最高，這可能是由于其處在快速生長期，消化酶活性高，因此，所表現(xiàn)出來的消化性能較好。

藍(lán)藻偽空胞破碎后，光吸收面積減少，藻細(xì)胞內(nèi)部散射光照強度減弱，光合作用降低，藍(lán)藻的活性基本不受影響。在適當(dāng)?shù)墓庹諒姸认拢瑐慰瞻屏训你~綠微囊藻會在3～5 d內(nèi)恢復(fù)，加壓下沉的藍(lán)藻細(xì)胞會產(chǎn)生不同程度的上浮，而低光照強度藍(lán)藻氣囊恢復(fù)緩慢[6,38]。所以壓力作用后，短期內(nèi)如果能被魚類消化吸收，就能快速轉(zhuǎn)移藍(lán)藻的能量到更高的營養(yǎng)級中，從而快速轉(zhuǎn)化N、P物質(zhì)。陳少蓮等[34]提出微囊藻經(jīng)初次消化后排出形成的魚糞，在水體中離散呈微小顆粒狀態(tài)，若再次被攝食后更容易被鰱、鳙消化，且有研究表明，由單細(xì)胞組成、結(jié)構(gòu)簡單的藻類更容易被消化[39]。本研究中，結(jié)合消化試驗和電鏡觀察試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，液壓藍(lán)藻細(xì)胞在攝食前、中腸和糞便中的狀態(tài)均比未液壓的藍(lán)藻要更利于消化吸收，這表明，0.7 MPa壓力作用后的藍(lán)藻有利于濾食性生物對藍(lán)藻的消化利用，符合預(yù)想情況。

4 結(jié)論

單一的物理技術(shù)和生物技術(shù)處理藍(lán)藻均存在較大的不確定性，本試驗中采取綜合處理技術(shù)，結(jié)合壓力破碎技術(shù)和非經(jīng)典生物操縱方法，取得的主要結(jié)論如下：

1) 加壓處理前藍(lán)藻漂浮在水面，嚴(yán)重影響水體環(huán)境和景觀；加壓處理后藍(lán)藻偽空胞破裂，下沉性可得到加強，水體透明度提高。

2) 與未加壓處理的藍(lán)藻細(xì)胞相比，加壓處理后的藍(lán)藻間膠質(zhì)消失，多趨向于單個個體，邊緣清晰；經(jīng)鳙攝食后，中腸內(nèi)和糞便中藻細(xì)胞的凹陷程度和破裂程度均更高，說明加壓處理后藍(lán)藻細(xì)胞更容易被消化，從而加速水體氮、磷等營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)移，生態(tài)效益更大。

3) 本試驗條件下，103 g左右的鳙對藍(lán)藻的消化率最高，這可能是由于餌料組成和魚體生長發(fā)育期的不同而引起的消化酶活性的差異，但對于其具體的影響機理較為復(fù)雜，尚需進(jìn)一步研究。依據(jù)本試驗結(jié)果，為提高生態(tài)效益，建議在增殖放流實踐中，可適當(dāng)增加此類規(guī)格魚類的放流。

感謝水生生物資源室老師及同事對試驗提出的指導(dǎo)與幫助；感謝無錫德林海環(huán)?？萍脊煞萦邢薰緦υ囼灅悠窚?zhǔn)備所提供的幫助。