裙帶菜孢子體潰爛病原鑒定及病因分析

李赟,張賽賽, 孫陽,王宏飛,陳文博*

(1.大連市現代農業(yè)生產發(fā)展服務中心，遼寧 大連 116023；2.遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081)

裙帶菜Undariapinnatifida隸屬于褐藻門褐子綱海帶目翅藻科裙帶菜屬，精選的裙帶菜其營養(yǎng)可以與螺旋藻媲美，在日本稱其為“天然螺旋藻”。裙帶菜是微量元素和礦物質的天然寶庫，含有十幾種人體所需的氨基酸及鈣、碘、鋅、硒、葉酸，以及維生素A、B、C等礦物質。裙帶菜含鈣量是“補鈣之王”牛奶的10倍，含鋅量是“補鋅能手”牛肉的3倍。500 g裙帶菜含鐵量等于10.05 kg菠菜，含維生素C量等于0.75 kg胡蘿卜，含蛋白質量等于1.5個海參。其含碘量也比海帶多，加上富含氨基酸、粗纖維等微量元素，對兒童的骨骼、智力發(fā)育極為有益。裙帶菜還可作為刺參飼料原料，助力海參產業(yè)[1]，其提取物裙帶菜凝集素能提高日本對蝦非特異性免疫[2]，提取物褐藻多糖硫酸酯混合制劑有降血脂作用[3]。

裙帶菜在遼寧、山東沿海廣為養(yǎng)殖，并發(fā)展為當地重要的支柱產業(yè)。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，其病害問題表現得越來越突出，裙帶菜潰爛成為裙帶菜養(yǎng)殖優(yōu)質、高產、穩(wěn)產的重大障礙。大量研究表明，裙帶菜潰爛是由多方面因素引起的，致病原因也非常復雜，包括海區(qū)環(huán)境如溫度、光照、鹽度、營養(yǎng)鹽、pH、潮汐差、栽培密度及微生物因素等，其中，微生物因素是不可忽視的重要原因之一。如馬悅欣等[4-5]于1997年首次報道并命名了綠爛病和斑點爛病,并從患病葉狀體中分離出火神弧菌和優(yōu)美德利菌,其后姜靜穎等[6]研究了綠爛病病原火神弧菌對宿主感染情況。2018 年 2—3 月，大連市龍王塘和旅順增養(yǎng)殖海域的裙帶菜大面積潰爛，主要表現為葉片頂端出現潰爛，藻體難以展平，邊緣皺縮，后期完全腐爛。以患病裙帶菜葉狀體搗爛組織進行細菌學檢驗，結果在褐藻酸鈉固體選擇性培養(yǎng)基上分離到 2 種大量優(yōu)勢生長的細菌(編號為 LQ2 和 LH43)。本研究中，對分離菌株的致病性、生理生化特性、16S rRNA 基因序列的系統發(fā)育學及抗生素藥敏特性進行了分析，以期為裙帶菜病害的研究提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病裙帶菜樣品采自大連市龍王塘和旅順鐵山增養(yǎng)殖海域。供感染的健康裙帶菜采自金州大李家海域。

培養(yǎng)基及細菌微量生化反應管等均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 取裙帶菜患病部位，經生理鹽水沖洗后于滅菌后的研缽中勻漿，取0.1 mL勻漿液分別涂布于2216E瓊脂培養(yǎng)基、TCBS培養(yǎng)基、褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基及纖維素鈉固體培養(yǎng)基平板上，參考養(yǎng)殖伐區(qū)環(huán)境溫度并于10 ℃下培養(yǎng)。褐藻酸鈉固體選擇性培養(yǎng)基成分: 0.5%褐藻酸鈉+0.5%(NH4)2SO4+0.2% K2HPO4+0.2% MgSO4·7H2O+2.5% NaCl+0.01% FeSO4·7H2O+1.3% 瓊脂(均為質量分數)，pH為 7.5。

1.2.2 優(yōu)勢菌與裙帶菜潰爛病的相關性試驗 選用長度1 m以下的整株藻體，挑選色澤正常、生長健壯的裙帶菜葉狀體，將假根(固著器)夾入繩內，將藻體吊養(yǎng)在玻璃鋼水槽(1.6 m×0.8 m×1.6 m)中，每個水槽中吊掛5株個體，培養(yǎng)溫度為(12±1)℃。試驗前將藻體用毛筆刷洗干凈，在體積分數1%檸檬酸海水溶液中潤洗片刻，再用潔凈海水沖洗掉葉狀體表面的檸檬酸液，暫養(yǎng)3 d。

將分離的兩種優(yōu)勢菌株(編號分別為LQ2和LH43)接種于營養(yǎng)肉湯中，10 ℃下過夜培養(yǎng)，逐級擴大培養(yǎng)至體積2 L，密度分別為5.4×109、4.1×109CFU/mL。將供試菌均勻加入玻璃鋼水槽中，海水中LQ2和LH43菌體的終密度分別為 5.4×106、4.1×106CFU/mL，在室溫自然光照條件下培養(yǎng)。同時試驗設無菌營養(yǎng)肉湯對照組和空白對照組。

1.2.3 優(yōu)勢菌株的形態(tài)觀察與鑒定 參考閆詠等[7]的方法對分離菌株進行形態(tài)及理化特性測定。將供試菌株制備成涂片標本，經革蘭氏染色后鏡檢；采用生化試驗法測定菌株的理化特性[8-9]。純化后的單菌落用體積分數2.5%的戊二醛固定液處理，在透射電鏡下觀察形態(tài)。

按照張曉君等[10]的方法擴增分離菌的16S rRNA基因序列，使用PCR 擴增通用引物對(27F、1492R)[11]，將擴增獲得的16S rRNA序列與 NCBI數據庫中16S rRNA序列進行比對，獲得同源關系較近序列。將從GenBank 數據庫中獲得的序列相似性較高菌株序列進行多序列匹配排列，采用Mega 6.0軟件，使用鄰接法(Neighbor-joining)構建分子系統發(fā)生樹，并通過Bootstrap 法(1 000 次重復)進行檢驗。

1.2.4 優(yōu)勢菌株胞外產物褐藻酸裂解酶活力的測定 采用陳洪基等[12]的方法測定分離純化酶及其酶活力。褐藻酸裂解酶活定義:在規(guī)定試驗條件下，每分鐘產生1 μg還原性糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。在pH為7.5條件下，以最大酶活力為100%，測定褐藻酸裂解酶在5～30 ℃的相對酶活力，等溫度梯度設置6個試驗溫度，以確定酶反應的最適溫度。

1.2.5 藥敏特性試驗 依據美國NCCLS試驗標準方法[13]，通過K-B法測定分離菌株對14種抗生素的敏感特性。將菌株接種于營養(yǎng)肉湯中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中24 h，調整菌液密度為3.0×107CFU/mL，采用酶標儀微量法確定菌液密度[14]。將14種藥敏紙片輕壓于涂布150 μL菌液的培養(yǎng)基表面，28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑，參照藥敏紙片說明書，判斷菌株的藥物敏感特性。

2 結果與分析

2.1 細菌分離、形態(tài)特征及致病性

在2216E瓊脂培養(yǎng)基上及褐藻酸鈉固體培養(yǎng)基上均分離得到 2 株優(yōu)勢生長的菌株。 菌落特征為圓形光滑整齊、較隆起、淺黃色半透明；LQ2 菌落特征為不透明、乳白色，在瓊脂為唯一碳源的合成培養(yǎng)基上生長較緩慢。兩菌株菌落較小，直徑多為0.5 mm 左右；TCBS 培養(yǎng)基中均未生長。

革蘭氏染色結果均為陰性菌(圖1(a)、(b))；透射電鏡下可見LH43菌體大小略有不同，約為0.60 μm×1.01 μm(圖1(c))，細菌細胞壁厚度較大，只能觀察到菌體大小輪廓；透射電鏡下可見LQ2菌體大小略有不同，約為0.59 μm×1.20 μm(圖1(d))。

圖1 菌株形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of the bacterial strains

用分離菌株感染健康裙帶菜葉狀體 48 h 后，藻體邊緣顏色變淡，葉狀體邊緣出現黑色斑點，繼續(xù)養(yǎng)殖，最后藻體邊緣逐漸腐爛分解。肉湯對照組和空白對照組葉狀體生長正常，發(fā)育同自然狀態(tài)一致，無明顯變化。

2.2 生化試驗結果

從表1可見：LH43、LQ2菌株氧化酶反應均呈陽性，其中LQ2菌株過氧化氫酶反應呈陽性；LH43菌株能利用葡萄糖、麥芽糖、乙酰胺酶和淀粉酶，能合成胞外DNA酶；LQ2菌株能利用乙酰胺酶、硝酸鹽和丙二酸鹽；加入質量分數為1%、3%、6% NaCl，兩菌株均能生長。

表1 LH43和LQ2菌株的生化試驗結果Tab.1 Biochemical test results of the strain LH43 and the strain LQ2

2.3 16S rRNA基因序列與系統發(fā)育分析

用LH43和LQ2菌株擴增出的16S rRNA基因序列長度分別為1 450 bp和1 453 bp。將兩菌株的16S rRNA 基因序列在NCBI數據庫中進行Blast同源性比對，LH43菌株與北極假單胞菌屬細菌Pseudoalteromonasarctica的一致性為99%，且二者的16S rRNA基因序列自然聚為一支，親緣關系較近(圖2)。LQ2菌株與嗜冷桿菌屬細菌Psychrobacteraquimaris的一致性為100%，且二者的16S rRNA 基因序列自然聚為一支，親緣關系較近(圖3)。

圖2 LH43菌株的系統發(fā)育分析Fig.2 Analysis of phylogenetic tree of strain LH43

圖3 LQ2菌株的系統發(fā)育分析Fig.3 Analysis of phylogenetic tree of strain LQ2

2.4 菌種分類地位

綜合菌落形態(tài)、生理生化結果在伯杰細菌手冊(第八版)中比對結果及 16S rRNA 基因序列分子系統發(fā)育分析結果，可確定LH43菌株為北極假交替單胞菌Pseudoalteromonasarctica，LQ2菌株為嗜冷桿菌屬細菌Psychrobacteraquimaris。

2.5 菌株生長與產酶特性分析

將兩菌株于不同溫度下培養(yǎng)48 h，發(fā)現LH43和LQ2菌株最適生長溫度為5～10 ℃，胞外產物褐藻酸裂解酶活力最高為15 ℃(圖4、圖5)。

圖4 溫度對LH43菌株生長及酶活力的影響Fig.4 Effects of temperature on the growth and enzyme activity of strain LH43

圖5 溫度對LQ2菌株生長及酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the growth and enzyme activity of strain LQ2

2.6 藥物敏感特性

從表2可見：LH43菌株對慶大霉素、卡那霉素、氟羅沙星及鏈霉素高度敏感，對阿奇霉素、克拉霉素、諾氟沙星、多黏菌素B和左氧氟沙星中度敏感，對氨芐西林、青霉素、四環(huán)素、頭孢唑林和頭孢氨芐不敏感；LQ2菌株對慶大霉素、卡那霉素、青霉素、阿奇霉素高度敏感，對克拉霉素、多黏菌素B、諾氟沙星和氟羅沙星中度敏感，對氨芐西林、鏈霉素、四環(huán)素、左氧氟沙星、頭孢唑林和頭孢氨芐不敏感。

表2 14種抗生素藥敏試驗結果Tab.2 Results of 14 antibiotic susceptibility tests

3 討論

3.1 菌株的鑒定

本試驗中，從大連市龍王塘和鐵山增養(yǎng)殖海域發(fā)生潰爛病的浮筏養(yǎng)殖裙帶菜中分離到在褐藻酸鈉固體選擇性培養(yǎng)基優(yōu)勢生長的細菌，通過形態(tài)觀察與生理生化反應及16S rRNA序列在 NCBI比對結果等，確定LH43菌株為北極假交替單胞菌Pseudoalteromonasarctica，LQ2菌株為嗜冷桿菌Psychrobacteraquimaris。

3.2 菌株的致病性

假交替單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，嚴格需氧，生長需要Na+，該菌株可見于海水、沉積物、海冰、海藻及海洋無脊椎動物[15]。 近年來，已有假交替單胞菌屬某些種可引起水生生物感染發(fā)病的報道，閆詠等[7]報道，檸檬假交替單胞菌Pseudoalteromonascitrea可引起條斑紫菜發(fā)生綠斑??；陳麗等[16]報道，假交替單胞菌Pseudoalteromonassp.也可引起紫菜褐斑病。嗜冷桿菌屬為革蘭氏陰性桿菌或球菌，能夠在5 ℃以下生長，一般在35～37 ℃不能生長[9]。嗜冷桿菌廣泛存在于海洋環(huán)境中，陳騳等[17]報道，嗜冷桿菌屬細菌也可引起紫菜褐斑病。北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌廣泛存在于海洋環(huán)境中，是海洋中極常見和重要的細菌，也是藻體上的主要附生細菌。北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌是條件致病菌，在海帶、裙帶菜、魚類、貝類等海洋生物體內均有分布，其營養(yǎng)要求低，能產生內毒素、脂酶、蛋白酶等許多與致病性有關的物質[16，18]。正常情況下，由于藻體保持著較高的抗感染能力，在藻—菌間形成一種動態(tài)平衡關系，這時并不能引發(fā)疾病。但是，當養(yǎng)殖水體惡化、水溫過高、養(yǎng)殖密度過大或出現機械損傷時，隨著藻體抵抗力下降，菌體易于侵入，在胞外產物褐藻酸裂解酶的作用下導致病害發(fā)生[17]。

北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌均能夠利用褐藻酸鈉產生褐藻酸酶，分解裙帶菜體內的褐藻酸；人工感染試驗結果也初步表明，上述分離的兩株菌均能夠使健康裙帶菜出現潰爛。Yumoto 等[19]認為，褐藻酸降解Alteromonassp.可引起海帶潰爛?。欢∶利怺20]用能夠降解褐藻酸的菌接種于健康海帶表面，發(fā)現其侵入海帶表面的分生組織，然后進入外皮層、內皮層和髓部，導致細胞游離，部分游離細胞的細胞壁破損，在破損細胞的周圍布滿了細菌。本研究中分離的兩菌株，北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌最適生長溫度為5～10 ℃，兩種菌代謝產生的胞外產物褐藻酸裂解酶在15 ℃時酶活力最高。在發(fā)生潰爛病的時候，養(yǎng)殖海域監(jiān)測水溫為13.4 ℃，這與本研究中褐藻酸裂解酶活力最高溫度極為接近。初步推測在水溫低于10 ℃時，北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌大量繁殖，隨著海區(qū)水溫的慢慢升高，細菌代謝產生的褐藻酸裂解酶活力逐漸增強，從而導致裙帶菜潰爛發(fā)生，這與Lee等[21]的研究結果相似。因此，筆者認為裙帶菜潰爛病的發(fā)生與北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌具有較強相關性，更詳細的研究工作需要進一步開展。

3.3 菌株的耐藥性

藥敏試驗結果顯示，LH43菌株對慶大霉素、卡那霉素、氟羅沙星及鏈霉素高度敏感，LQ2菌株對慶大霉素、卡那霉素、青霉素、阿奇霉素高度敏感，雖然在海區(qū)養(yǎng)殖過程中用藥可行性極低，但該試驗結果可以作為北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌引起的裙帶菜病害和裙帶菜幼苗期管理的參考資料。

4 結論

1) 初步確定裙帶菜潰爛病的發(fā)生與北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌具有較強相關性。北極假交替單胞菌和嗜冷桿菌能在褐藻酸鈉固體選擇性培養(yǎng)基生長，均為革蘭氏陰性菌，兩菌株最適生長溫度為5～10 ℃，兩菌株代謝產生的胞外產物褐藻酸裂解酶在15 ℃時酶活力最高。

2) LH43菌株對慶大霉素、卡那霉素、氟羅沙星及鏈霉素高度敏感，LQ2菌株對慶大霉素、卡那霉素、青霉素、阿奇霉素高度敏感。