暗紋東方鲀leptin基因的克隆、SNP篩選及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

余云登，朱浩擁，王盛南，王耀輝，馬文超，楊曉，朱永祥，錢曉明，王秀利*

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.江蘇中洋集團(tuán)，江蘇 海安 226600)

瘦素(Leptin)又稱OB蛋白，是由肥胖基因OB編碼的一類蛋白激素，OB基因最早由Zhang等[1]通過圖位克隆技術(shù)從小鼠脂肪組織中分離、克隆得到。哺乳動(dòng)物的Leptin主要在白色脂肪組織(WAT)中合成，其受體廣泛表達(dá)于中樞和外周系統(tǒng)的組織中[2]，Leptin與這些特定受體結(jié)合調(diào)控動(dòng)物的攝食[3-4]、脂質(zhì)代謝[3]、血管生成[5]、骨骼重塑[6]、免疫[7]和繁殖[8]等重要生命活動(dòng)。

哺乳動(dòng)物的Leptin屬于長鏈螺旋細(xì)胞因子家族，其三維結(jié)構(gòu)特征主要包括4個(gè)反向平行的α螺旋[9]。2005年，硬骨魚的leptin基因首次從紅鰭東方鲀Takifugurubripes[10]中克隆得到，之后還從多種硬骨魚中克隆和鑒定出了leptin基因。與哺乳動(dòng)物不同，硬骨魚的leptin基因主要在肝臟中表達(dá)[10-11]，且哺乳動(dòng)物的leptin只有一種，而已有研究表明，除鲀形目與部分鱸形目的種類只有一種leptin外，其他多數(shù)硬骨魚含有2種甚至4種leptin亞型[12]，不同亞型基因的空間表達(dá)有較大差異，表明這些亞型發(fā)揮的生理功能不同[13-15]。硬骨魚Leptin氨基酸序列與哺乳動(dòng)物相比相似性較低，但三級(jí)結(jié)構(gòu)十分保守，均包含4個(gè)α螺旋[10, 13-16]。與哺乳動(dòng)物相似，硬骨魚的Leptin同樣是影響多種生物學(xué)功能的調(diào)控因子。在同源Leptin注射試驗(yàn)[12, 16]及對(duì)魚體不同攝食狀態(tài)leptin基因表達(dá)量的檢測[13-16]中均顯示，leptin與抑制攝食有相關(guān)性。此外，leptin對(duì)硬骨魚的脂質(zhì)也有調(diào)節(jié)作用[17]，但并不像在哺乳動(dòng)物中一樣作為主要的脂肪抑制因子。在leptin對(duì)硬骨魚生殖影響的研究中發(fā)現(xiàn)leptin基因的表達(dá)與大西洋鮭Salmosalar及鯖Pneumatophorusjaponicus的精巢發(fā)育有關(guān)[18-19]；同源leptin能誘導(dǎo)雌性鯖魚的促性腺激素分泌[20]。但在對(duì)缺乏功能性leptin受體斑馬魚的研究中發(fā)現(xiàn)，受體缺失的斑馬魚并不會(huì)像leptin受體缺乏的小鼠一樣喪失生育能力，且未表現(xiàn)出食欲過高或肥胖[21]，這表明leptin在硬骨魚中的生理作用與哺乳動(dòng)物相比有較大不同，還有待更進(jìn)一步研究。

暗紋東方鲀Takifuguobscurus是中國特有的河鲀種類，屬于硬骨魚綱鲀形目鲀科東方鲀屬，主要分布于中國東、黃海沿海，還可進(jìn)入長江并棲息于太湖，屬廣鹽性魚類，是著名的“長江三鮮”之一，具有較高的營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[22-24]。暗紋東方鲀和紅鰭東方鲀是中國養(yǎng)殖及食用范圍最廣的兩個(gè)河鲀品種[24]，但前者和后者相比有著生長速度慢的缺點(diǎn)[25]，這在一定程度上限制了暗紋東方鲀相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，SNP)是指生物不同個(gè)體 DNA 序列中單個(gè)核苷酸點(diǎn)突變產(chǎn)生的多態(tài)性[26]。SNP作為一種位點(diǎn)數(shù)量多、密度廣、遺傳多樣性高的分子標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于與水產(chǎn)動(dòng)物生長性狀相關(guān)的研究中[27-29]。本研究中，克隆了暗紋東方鲀東方鲀leptin基因cDNA序列，并基于leptin在硬骨魚生長發(fā)育過程中發(fā)揮的重要作用，通過直接測序篩選得到暗紋東方鲀leptin基因中分型穩(wěn)定、多態(tài)性好的SNP位點(diǎn)，并與暗紋東方鲀生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，獲得與生長性狀顯著相關(guān)的位點(diǎn)作為暗紋東方鲀輔助育種的候選分子標(biāo)記，以提高選育效率。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用暗紋東方鲀均來自江蘇中洋集團(tuán)，隨機(jī)選擇6尾健康的3月齡幼魚作為基因克隆的試驗(yàn)樣本；隨機(jī)選擇同期繁殖、同塘養(yǎng)殖的178 尾8月齡魚，測量其體質(zhì)量、體長、體全長指標(biāo)，剪取背鰭風(fēng)干保存，作為SNP與生長性狀關(guān)聯(lián)分析的試驗(yàn)樣本。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 取6尾3月齡暗紋東方鲀幼魚，用 MS-222 麻醉后解剖，剪取肝臟組織經(jīng)液氮低溫處理后于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成 使用Trizol試劑(TaKaRa)進(jìn)行總RNA提取，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的完整性。使用Primer Script RT reagent Kit(TaKaRa)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3leptincDNA克隆 參照NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的紅鰭東方鲀leptin基因mRNA序列信息(GenBank登錄號(hào)：NM_001032725.1)，設(shè)計(jì)包含紅鰭東方鲀蛋白編碼區(qū)(CDS)的1對(duì)引物(表1)，采用RT-PCR法克隆暗紋東方鲀的leptin基因。cDNA克隆的反應(yīng)體系(25 μL)包含：10×PCR Buffer 2 μL，上、下游引物(mlep-F /mlep-R)各1 μL，Taq酶 0.5 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，60 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.4leptin基因序列分析 利用ORF Finder在線工具(https://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find. html)預(yù)測基因的開放閱讀框及其編碼的氨基酸序列；以預(yù)測的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行同源比對(duì)，選取部分物種的Leptin氨基酸序列，利用MEGA Χ軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用Expasy蛋白組服務(wù)器(https://www.expasy.org)中的Protparam分析Leptin蛋白的生理生化特征，用ProtScale預(yù)測其親疏水性，用PROSITE預(yù)測氨基酸序列功能域；使用Signal P4.1 Server(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對(duì)Leptin蛋白信號(hào)肽進(jìn)行分析；用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ sopma.html)預(yù)測蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL(http: / /www.swissmodel.expasy. org)構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)模型。

1.2.5 基因組DNA的提取與檢測 使用TIANamp Marine Animals DNA Kit(天根生化科技(北京)有限公司)提取暗紋東方鲀基因組DNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質(zhì)量并置于冰箱(-20 ℃)中保存待用。

1.2.6leptin基因的PCR擴(kuò)增及突變位點(diǎn)基因分型 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中紅鰭東方鲀的基因組數(shù)據(jù)(GenBank登錄號(hào)：NC_042293.1)設(shè)計(jì)1對(duì)引物(表1)，從178個(gè)暗紋東方鲀DNA樣本中隨機(jī)挑選24個(gè)樣本PCR擴(kuò)增leptin基因的片段，通過比對(duì)測序結(jié)果篩選SNP位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)包含：10×PCR Buffer 5 μL，上、下游引物(lep-F/lep-R )各2 μL，Taq酶 0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，暗紋東方鲀基因組DNA模板2 μL，ddH2O 34.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃下預(yù)變性5 min；94 ℃下變性30 s，65 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接送北京六合華大基因科技有限公司測序。返回結(jié)果用seqMan軟件進(jìn)行拼接比對(duì)后得到多態(tài)性高、分型穩(wěn)定的突變位點(diǎn)，并與克隆得到的暗紋東方鲀cDNA序列及紅鰭東方鲀基因組數(shù)據(jù)(GenBank登錄號(hào)：NC_042293.1)比對(duì)確定基因結(jié)構(gòu)。通過直接測序?qū)?78尾暗紋東方鲀leptin基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行分型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Popgene 32軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)，并進(jìn)行哈溫平衡檢驗(yàn)(HWE)；采用PIC_CALC軟件計(jì)算SNP位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)；采用Haploview軟件對(duì)leptin基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析；采用SPSS 19.0軟件對(duì)篩選到的SNP位點(diǎn)與暗紋東方鲀的生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紋東方鲀leptin基因cDNA序列及推測的氨基酸序列結(jié)構(gòu)

克隆得到的暗紋東方鲀leptincDNA序列長為661 bp，包括459 bp的開放閱讀框，共編碼152個(gè)氨基酸(圖1)，克隆序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中(登錄號(hào)：MT832308)。推測的Leptin蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為19 948.69，等電點(diǎn)為6.90，不穩(wěn)定值為28.31，親水性的總體平均值(GRAVY)為-0.089，結(jié)合ProtScale預(yù)測結(jié)果，推測該蛋白為親水的穩(wěn)定蛋白。Leptin氨基酸序列含19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，功能位點(diǎn)包含1個(gè)N-豆蔻?；稽c(diǎn)、3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)和1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(圖1)。

推測的Leptin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(h)占 71.71%，β-折疊(e)占 2.63%，β-轉(zhuǎn)角(t)占 1.32%，無規(guī)卷曲(c)占 24.34%。使用SWISS-MODEL在線工具獲得Leptin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.2 Leptin氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

同源性分析結(jié)果顯示：暗紋東方鲀Leptin氨基酸序列與紅鰭東方鲀的一致性最高，為96.71%；其次為菊黃東方鲀，一致性為93.42%；與其他不同種屬的魚類一致性較低，其中與草魚Leptin氨基酸序列的一致性僅為25.25%，而與其他脊椎動(dòng)物的一致性則更低?；隰~類和其他脊椎動(dòng)物L(fēng)eptin氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，進(jìn)化樹可聚為魚類、鳥類、兩棲類和哺乳類4類，其中魚類中，草魚、鯉、鰱聚為一個(gè)分支，暗紋東方鲀、菊黃東方鲀、紅鰭東方鲀聚為另一個(gè)分支(圖3)。進(jìn)化樹分析與傳統(tǒng)分類結(jié)果相一致。

2.3 leptin基因SNP位點(diǎn)的篩選

對(duì)24個(gè)暗紋東方鲀DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，獲得了長度為691 bp的leptin基因片段，片段包括2個(gè)外顯子(外顯子2，外顯子3)及1個(gè)內(nèi)含子(內(nèi)含子2)。通過序列比對(duì)，在暗紋東方鲀leptin基因中篩選得到2個(gè)分型穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)：一個(gè)位于外顯子2(T24G)，為同義突變未改變氨基酸的編碼；另一個(gè)發(fā)生在內(nèi)含子2(T193A)。本研究中，核酸位置以基因起始密碼子的第一個(gè)堿基為參考值1，統(tǒng)計(jì)所有178個(gè)序列，得到2個(gè)SNP的等位基因頻率和基因型頻率如表2所示。

表2 leptin基因2個(gè)SNP等位基因及基因型頻率

2.4 leptin基因SNP在暗紋東方鲀?nèi)后w中的遺傳結(jié)構(gòu)分析

統(tǒng)計(jì)2個(gè)突變位點(diǎn)的遺傳參數(shù)，結(jié)果如表3所示,其中，T24G中有效等位基因數(shù)Ne、觀測雜合度Ho、期望雜合度He、多態(tài)信息含量PIC數(shù)值均高于T193A，T24G是中度多態(tài)性位點(diǎn)(0.25≤PIC<0.5)，T193A位點(diǎn)是低度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC<0.25)。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，leptin基因的2個(gè)SNP在暗紋東方鲀?nèi)后w中處于哈溫平衡狀態(tài)(P>0.05)。Haploview軟件的連鎖分析顯示，2個(gè)SNP間的r2為0.005，表明兩個(gè)位點(diǎn)彼此獨(dú)立。

表3 leptin基因SNP位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Tab.3 Genetic parameters of SNP loci in leptin gene

2.5 leptin基因SNP與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

采用SPSS 19.0軟件分析不同基因型(頻率低于2.5%的基因型排除)與生長性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明，T24G位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體質(zhì)量存在顯著性差異(P<0.05)，GG基因型個(gè)體體質(zhì)量顯著小于TG和TT基因型(P<0.05)，為劣勢基因型(表4)。

表4 leptin基因SNP位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

將2個(gè)SNP位點(diǎn)的不同基因型進(jìn)行組合，得到7種雙倍型，去除頻率低于2.5%的D3和D7，將其余5種與生長進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(表5)，結(jié)果顯示，雙倍型D5的3個(gè)生長性狀值最高，體質(zhì)量顯著高于D2、D4型個(gè)體(P<0.05)，極顯著高于D6型個(gè)體(P<0.01)，體長和體全長均顯著高于D6型個(gè)體(P<0.05)。

表5 leptin基因不同雙倍型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 Correlation analysis of different diplotypes of leptin gene and growth traits

3 討論

3.1 暗紋東方鲀leptin基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)

本研究中,以近緣物種紅鰭東方鲀leptin基因的mRNA序列為參照，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增得到了暗紋東方鲀的leptincDNA。預(yù)測蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型顯示，暗紋東方鲀Leptin符合Leptin的基本特征，蛋白結(jié)構(gòu)包含4個(gè)α螺旋。多物種Leptin氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，物種間Leptin蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)存在較大差異，這表明物種間Leptin的功能存在較大差異。已有研究顯示，在哺乳動(dòng)物中，Leptin是主要的脂肪抑制因子，但在硬骨魚中Leptin對(duì)脂肪穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)并不明顯。Leptin受體缺失的斑馬魚并未表現(xiàn)出受體缺失小鼠食欲亢進(jìn)、代謝提高和明顯肥胖的狀態(tài)。在硬骨魚中Leptin主要在葡萄糖的穩(wěn)態(tài)調(diào)控中發(fā)揮作用，且調(diào)節(jié)葡萄糖的穩(wěn)態(tài)似乎是硬骨魚和哺乳動(dòng)物中的一種保守功能[21]。這可能與物種間Leptin相對(duì)穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。本研究中，同源性分析顯示，暗紋東方鲀Leptin氨基酸序列與同屬于東方鲀屬的紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀序列的一致性較高，均在90%以上，這表明Leptin在東方鲀屬物種中的功能相對(duì)保守，而與其他硬骨魚、鳥類、兩棲類及哺乳類Leptin序列的一致性較低，這表明Leptin在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了較大變化。

3.2 暗紋東方鲀leptin基因SNP與生長關(guān)聯(lián)

本研究中，基于Leptin在硬骨魚生長發(fā)育中的重要作用，以leptin基因作為暗紋東方鲀生長性狀的候選基因，通過直接測序方法篩選到了2個(gè)分型穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)(T24G、T193A)。T24G位于編碼區(qū)發(fā)生同義突變，未改變氨基酸的編碼。但由于密碼子的偏好性[30]，突變的同義密碼子可能不是相應(yīng)生物的最佳密碼子，甚至可能突變?yōu)榈托艽a子。這可能會(huì)影響氨基酸的編碼效率，進(jìn)而影響對(duì)應(yīng)基因在生物中的功能發(fā)揮。本研究中關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，T24G位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的體質(zhì)量性狀存在顯著性差異(P<0.05)，GG基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量比TT基因型低9.22%，比TG基因型低11.63%，對(duì)暗紋東方鲀的生長不利，因此，可以通過篩除GG基因型提高暗紋東方鲀的生長性能。T193A位點(diǎn)發(fā)生于內(nèi)含子，大多數(shù)SNP位點(diǎn)都發(fā)生在內(nèi)含子，在人類基因組中內(nèi)含子、外顯子及毗連的非翻譯區(qū)的SNP密度分別為8.21、5.288、7.51 SNP/10 kb[31]。內(nèi)含子雖然不參與編碼氨基酸，但可通過影響轉(zhuǎn)錄速率和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性增加轉(zhuǎn)錄水平，此外，內(nèi)含子還可以提高mRNA的翻譯效率[32]。已有的研究分別在大口黑鱸Micropterussalmoides[27]、紅鰭東方鲀[28]、草魚Ctenopharyngodonidella[29]等多種魚類基因的內(nèi)含子中篩選到了與生長相關(guān)的SNP位點(diǎn)。T193A位點(diǎn)未顯現(xiàn)出明顯的生長性狀相關(guān)性，但單個(gè)SNP所含信息有限，不同的SNP位點(diǎn)間可能存在相互作用，將不同SNP位點(diǎn)組合成雙倍型能顯現(xiàn)更多基因頻率信息[27, 33]。本研究中，將T24G和T193A的不同基因型進(jìn)行組合得到7種雙倍型，其中，D5型個(gè)體的體質(zhì)量比D1、D2、D4、D6分別高出10.55%、16.32%、10.96%、22.55%，具有顯著的生長優(yōu)勢。綜上所述，可將T24G位點(diǎn)的TG和TT基因型及雙倍型D5作為暗紋東方鲀輔助育種的候選分子標(biāo)記。

4 結(jié)論

1) 使用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆獲得了暗紋東方鲀leptincDNA序列長為691 bp。

2) 將暗紋東方鲀樣本PCR產(chǎn)物測序并比對(duì)篩選得到2個(gè)分型穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)。

3) 通過SPSS分析，T24G位點(diǎn)的TG和TT基因型及雙倍型D5是暗紋東方鲀優(yōu)勢生長的基因型，可作為輔助育種的候選分子標(biāo)記。