沼澤紅假單胞菌LuxR家族調控蛋白的生物信息學分析

楊艷北 許晶 李袁飛

摘要：LuxR家族調控蛋白調控革蘭氏陰性細菌群體感應系統(tǒng)，從而影響細菌生物被膜的形成。利用在線生物信息學預測軟件，分析LuxR家族調控蛋白序列，對其理化性質、親水性/疏水性、亞細胞定位、信號肽、二級結構、三級結構、磷酸化位點、跨膜結構域和功能結構域進行分析和預測，為后續(xù)研究生物被膜形成機制奠定基礎，也為生物被膜增強劑的開發(fā)提供新的思路。結果表明：LuxR家族調控蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白;定位在細菌的細胞質中;無信號肽結構，推斷其為非分泌性蛋白;二級結構中含有α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲等結構元件;α-螺旋和無規(guī)則卷曲對三級結構的穩(wěn)定和功能發(fā)揮具有重要意義;含有5個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點包括第79位、第165位和第171位氨基酸，其中蘇氨酸磷酸化位點包括第90位和第211位氨基酸;無跨膜結構域，推測LuxR家族調控蛋白不屬于跨膜蛋白;LuxR家族調控蛋白參與細菌群體感應系統(tǒng)，含有2個保守結構域，分別為Autoind_bind和 HTH_LUXR，該蛋白通過這2個保守結構域起到轉錄調控的作用。

關鍵詞：沼澤紅假單胞菌;LuxR;生物信息學;生物被膜

沼澤紅假單胞菌是光合細菌的代表菌株之一，屬于益生菌的一種，廣泛作為動物飼料添加劑和水質凈化劑使用。沼澤紅假單胞菌自身能夠產生生物被膜[1]，利用生物被膜這一天然保護狀態(tài)能夠提高細菌的存活率，增加活菌數(shù)量，穩(wěn)定產品質量。生物被膜是指細菌黏附于接觸物表面而形成的極其復雜的三維立體結構，這種復雜的細菌聚集體結構，抗逆性強，是大多數(shù)細菌在自然狀態(tài)下的生長方式。生物被膜使細菌能夠在惡劣的自然環(huán)境下生存和繁殖。與浮游狀態(tài)下的細菌相比，生物被膜狀態(tài)下的細菌具有更強的生存能力，例如抗冷凍能力、抗干燥能力、耐熱性和耐酸性等[2-3]。LuxR家族調控蛋白是一類在革蘭氏陰性細菌群體感應中起重要作用的調控蛋白，它們參與由?；呓z氨酸內酯介導的多種生物學過程，包括調控細菌生物被膜形成、質粒轉移、生物發(fā)光以及多種胞外酶、毒力因子和次生代謝產物的合成。LuxR家族調控蛋白通過群體感應系統(tǒng)影響生物被膜的形成[4]。本研究采用生物信息學的分析方法，對LuxR家族調控蛋白的理化性質、親水性/疏水性、亞細胞定位、信號肽、二級結構、三級結構、磷酸化位點、跨膜結構域和功能結構域進行分析和預測，為后續(xù)研究沼澤紅假單胞菌生物被膜形成機制奠定基礎，也為生物被膜增強劑的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

試驗中沼澤紅假單胞菌的LuxR家族調控蛋白序列來自于美國國家生物信息中心（NCBI）已登錄的序列，蛋白質序列編碼為WP_011155889.1（LuxR family transcriptional regulator[Rhodopseudomonas palustris]）。

1.2 研究方法

在線生物信息學預測軟件分析LuxR家族調控蛋白序列（試驗時間：2020年5月，試驗地點：江西省南昌市）：利用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析理化性質;利用ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）進行親水性、疏水性的分析和預測;利用PSORTb version 3.0.2 （https：//www.psort.org/psortb/）和LocTree3 （https：//www.rostlab.org/services/loctree3/）進行細菌亞細胞定位分析和預測;利用SignalP 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進行信號肽分析和預測;利用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）進行蛋白質二級結構分析和預測;利用SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質三級結構分析和預測;利用NetPhosBac 1.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhosBac-1.0）進行細菌蛋白質的磷酸化位點分析和預測;利用TMHMM 2.0 server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進行跨膜結構域的分析和預測;利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進行功能結構域分析和預測。

2 結果與分析

2.1 LuxR理化性質分析

利用ProtParam分析LuxR的理化性質。LuxR的氨基酸數(shù)量為243個，其中含量較多的氨基酸為丙氨酸（34個，14.0%）、亮氨酸（25個、10.3%），精氨酸（23個、9.5%）。LuxR的分子量為 26 937.94 u，理論等電點為7.73。LuxR含有4個半胱氨酸，說明LuxR可能具有二硫鍵。LuxR不含有吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸等稀有氨基酸。LuxR的氨基酸組成分別為丙氨酸（34個，14.0%）、精氨酸（23個，9.5%）、天冬酰胺（5個，2.1%）、天冬氨酸（14個，5.8%）、半胱氨酸（4個，1.6%）、谷氨酰胺（4個，1.6%）、谷氨酸（14個，5.8%）、甘氨酸（14個，5.8%）、組氨酸（6個，25%）、異亮氨酸（14個，5.8%）、亮氨酸（25個，10.3%）、賴氨酸（6個，25%）、甲硫氨酸（5個，2.1%）、苯丙氨酸（8個，33%）、脯氨酸（15個，6.2%）、絲氨酸（15個，6.2%）、蘇氨酸（11個，4.5%）、色氨酸（6個，25%）、酪氨酸（6個，2.5%）、纈氨酸（14個，58%）。LuxR帶負電荷氨基酸殘基數(shù)（天冬氨酸+谷氨酸）為28個，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)（精氨酸+賴氨酸）為29個，其分子式為C1 203H1 897N345O341S9，原子總數(shù)為3 795。假設LuxR的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現(xiàn)，即形成二硫鍵，LuxR的消光系數(shù)為 42 190 L/（mol·cm），吸光度（D280 nm）為1.566;假設二硫鍵全部打開，LuxR的消光系數(shù)為 41 940 L/（mol·cm），吸光度（D280 nm）為1.557。當LuxR的N端為甲硫氨酸時，在體外培養(yǎng)的網(wǎng)織紅細胞內的半衰期為30 h，在酵母菌細胞內的半衰期大于20 h，在大腸桿菌細胞內的半衰期大于10 h。LuxR的不穩(wěn)定系數(shù)為42.59，因此推測LuxR為不穩(wěn)定蛋白（蛋白質的穩(wěn)定系數(shù)大于閾值40時，其在溶液中性質不穩(wěn)定）。LuxR脂肪指數(shù)為93.29，親水性平均值為-0.075。LuxR親水性平均值為負值，表明此蛋白為親水性蛋白。

2.2 LuxR親水性/疏水性分析

利用ProtScale分析LuxR的親水性/疏水性。如圖1所示，LuxR多肽鏈中，第103位天冬氨酸和第176位異亮氨酸有最低分值-2.678，親水性最強;第204位異亮氨酸和第205位亮氨酸有最高分值2.111，疏水性最強;親水性氨基酸數(shù)量較多，且親水性平均值為-0.075，因此LuxR表現(xiàn)為親水性。

2.3 LuxR亞細胞定位分析

利用PSORTb version 3.0.2分析LuxR的亞細胞定位。PSORTb v3.0.2是目前最精確的細菌定位預測工具之一。LuxR的亞細胞定位分數(shù)分別為：細胞質9.97，細胞質膜0.01，周質0.01，外膜0.00，細胞外0.00。定位分數(shù)顯示LuxR定位在細菌的細胞質中。利用LocTree3分析LuxR的亞細胞定位。由圖2可見，LuxR定位在細胞質中，亞細胞定位分數(shù)95，精確度98%?；谏鲜?種在線軟件的亞細胞定位預測結果表明，LuxR定位在細胞質中。

2.4 LuxR信號肽分析

利用SignalP 4.1 Server分析LuxR的信號肽。由圖3可見，原始剪切位點C最大值在第55個氨基酸，分數(shù)為 0.154;綜合剪切位點Y最大值在第55個氨基酸，分數(shù)為0.154;信號肽S最大值在第42個氨基酸，分數(shù)為0.257;平均信號肽S值在第1～54個氨基酸之間，平均值是0.107;D值在第1～54個氨基酸之間，平均值是0.132;臨界值是0.570。D值是信號肽S最大值和綜合剪切位點Y最大值的平均值，對區(qū)分是否為分泌蛋白具有至關重要的作用。D值小于臨界值，LuxR未發(fā)現(xiàn)信號肽序列，因此推斷LuxR為非分泌性蛋白。

2.5 LuxR二級結構分析

利用SOPMA分析LuxR的二級結構。由圖4可見，LuxR可能包含的二級結構分別為：α-螺旋（藍色）115個，占47.33%;β-轉角（綠色）14個，占5.76%;延伸鏈（紅色）30個，占12.35%;無規(guī)則卷曲（紫色）84個，占34.57%。α-螺旋及無規(guī)則卷曲是LuxR二級結構中最大量的結構元件。

2.6 LuxR三級結構分析

利用SWISS-MODEL分析LuxR三級結構，得到6個預測模型，其中以PDB ID：2q0o.1.A為模板

的預測模型質量最高，作為本研究中的LuxR預測模型。由圖5可見，LuxR預測模型與模板序列相似度為24.11%。在本研究中，LuxR預測模型的全局模型質量評估分數(shù)（GMQE）為0.64，明顯高于其他預測模型，更接近1。GMQE是一種質量評估方法，生成的GMQE在0到1之間，數(shù)字越高，越接近1表明可靠性越高。在本研究中，LuxR預測模型的QMEAN分數(shù)為-2.45，比其他預測模型更接近0。QMEAN分數(shù)在0左右，表明模型結構與試驗結構具有良好的一致性。QMEAN分數(shù)在-4.0以下表示模型質量較低。通過SWISS-MODEL預測得出LuxR的三級結構（圖6），可見其α-螺旋和無規(guī)則卷曲結構豐富，數(shù)量較多。推測α-螺旋和無規(guī)則卷曲對LuxR三級結構的穩(wěn)定和功能發(fā)揮具有重要意義。

2.7 LuxR磷酸化位點分析

利用NetPhosBac 1.0 server分析LuxR的磷酸化位點。由圖7可見，磷酸化位點有5個，其中絲氨酸磷酸化位點包括：第79位氨基酸（殘基得分：0721），第165位氨基酸（殘基得分：0.635），第171位氨基酸（殘基得分：0.573）;蘇氨酸磷酸化位點包括：第90位氨基酸（殘基得分：0.545），第211位氨基酸（殘基得分：0.516）。殘基得分介于0和1之間，當?shù)梅指哂?.5時，殘基被預測為磷酸化位點。

2.8 LuxR跨膜結構域分析

利用TMHMM 2.0 server分析LuxR的跨膜結構域。如圖8所示，預測LuxR位于膜外（粉色細線）的概率接近100%，位于膜內（藍色細線）和跨膜區(qū)域（紅色細線）的概率幾乎為0。粉色粗線代表多肽鏈中跨膜區(qū)域所在位置。因LuxR無跨膜結構域，所以圖中不顯示相應的標記，推測LuxR不屬于跨膜蛋白。

2.9 LuxR功能結構域分析

利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫進行功能結構域分析，結果顯示，LuxR參與細菌的群體感應系統(tǒng)。由圖9可見，LuxR在第27～167位氨基酸處含有保守結構域Autoind_bind，該結構域與自誘導物分子能夠特異性結合，屬于轉錄調控因子超家族;LuxR在180～235位氨基酸處含有保守結構域HTH_LUXR，該結構域與DNA特異性結合，起到轉錄調控因子的作用，屬于α-螺旋蛋白結構域超家族。因此，LuxR通過Autoind_bind和HTH_LUXR 2個保守結構域起到轉錄調控的作用。

3 討論與結論

沼澤紅假單胞菌屬于益生菌的一種，在畜禽和水產養(yǎng)殖、農作物種植及污水處理方面表現(xiàn)出極高的應用價值[5]。益生菌的發(fā)展經過4個階段：第1代益生菌為不經包被處理的菌株，以浮游狀態(tài)或冷凍干燥狀態(tài)存在;第2代益生菌為藥用膠囊包被的冷凍干燥菌體;第3代益生菌為莢膜包被或微膠囊制備的菌劑;近幾年，第4代益生菌的研發(fā)正在蓬勃興起，其主要創(chuàng)新點就在于生物被膜狀態(tài)下的益生菌制備和微膠囊技術的換代升級[3，5]。在此研究的大背景下，本研究采用生物信息學的分析方法，對沼澤紅假單胞菌生物被膜形成過程中的關鍵調控蛋白LuxR的理化性質和結構特征進行預測，為后續(xù)研究沼澤紅假單胞菌生物被膜形成機制奠定堅實的基礎。

功能結構域分析結果顯示，LuxR家族調控蛋白參與細菌群體感應系統(tǒng)。細菌群體感應現(xiàn)象是指細菌數(shù)量達到一定閾值，同時信號分子的濃度也達到一定的水平，細菌之間通過信號分子進行交流，從而調控自身生理特征，并改變自身生理狀態(tài)的一種現(xiàn)象。細菌之間存在大量的信息交流和溝通，細菌不是完全獨立的個體[6-7]。LuxR系統(tǒng)作為革蘭氏陰性細菌中普遍存在的一種群體感應系統(tǒng)，在細菌的生存和繁衍過程中發(fā)揮著極其重要的調控作用，例如：LuxR家族調控蛋白通過群體感應系統(tǒng)影響生物被膜的形成，增強其對抗外界惡劣自然環(huán)境的能力[8-9]。LuxR家族調控蛋白能夠與?；呓z氨酸內酯結合，形成活性分子進而啟動下游相關基因的轉錄和翻譯[7，10-11]。LuxR型蛋白的N端為信號分子?；呓z氨酸內酯的結合區(qū)域，C端含有保守的螺旋-轉角-螺旋結構，能夠與目的基因特異性結合[4，12]，本研究中的LuxR家族調控蛋白也具有類似的二級和三級結構。雖然LuxR的高級結構大致相同，但是LuxR的一級結構差異明顯。不同種屬的微生物之間，LuxR一級結構的氨基酸序列差異較大，具有較多的替代氨基酸[4]。LuxR家族調控蛋白作為生物被膜形成過程中的關鍵蛋白[13]，是理想的生物被膜增強劑的候選蛋白，因此，通過不斷對其進行深入研究和分析，對生物被膜的人為控制將具有非常良好的誘人前景。本研究采用生物信息學的分析方法，對沼澤紅假單胞菌LuxR家族調控蛋白的理化性質和結構特征進行預測，為生物被膜增強劑的開發(fā)提供了新的思路。

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