高效液相色譜法測(cè)定半枝蓮不同富集方法所得總黃酮的含量

胡倩蓮，張婕妤，2，梅格格，李竹君，李心怡，田雅，方振峰*（.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，武漢 430056；2.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430074）

中藥材半枝蓮（Scutellaria barbataD.Don），別名狹葉韓信草、并頭草，最先見(jiàn)于《藥鏡拾遺賦》[1]，為唇形科植物半枝蓮的全草，常于夏季、秋季其莖葉茂盛時(shí)采挖。本品味辛、苦、性寒，歸肺經(jīng)[2]，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛、抗腫瘤等功能[3]。半枝蓮主要化學(xué)成分為生物堿、黃酮和多糖等[4]，其中黃酮類成分是半枝蓮抗腫瘤作用的主要活性成分之一，因其抗腫瘤作用機(jī)制的多樣化[5-8]，引起了科研工作者的極大興趣。

目前關(guān)于半枝蓮中總黃酮含量的測(cè)定已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，主要為以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定總黃酮含量[9-10]；或以黃芩苷為含量指標(biāo)，用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)樣品中總黃酮含量[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道[3，5-7]半枝蓮總黃酮中黃芩苷、木犀草素、野黃芩苷、芹菜素等單體成分表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，其中野黃芩苷的含量最高[13-14]，因此，研究半枝蓮總黃酮富集方法時(shí)，需考慮同時(shí)將幾種活性較好的黃酮單體成分的含量作為考察指標(biāo)。文獻(xiàn)中常見(jiàn)的總黃酮的富集方法主要集中于大孔吸附樹(shù)脂法，但對(duì)于經(jīng)典的總黃酮富集方法如堿提酸沉法，很少有報(bào)道，也很少有不同方法之間的對(duì)比。

本試驗(yàn)以抗腫瘤活性較好的單體成分木犀草素、野黃芩苷、芹菜素等含量之和為總黃酮含量指標(biāo)，通過(guò)優(yōu)化HPLC 條件，建立測(cè)定半枝蓮黃酮成分的方法。通過(guò)比較3 種總黃酮富集方法（溶劑萃取法、堿提酸沉法和大孔樹(shù)脂吸附法），探尋富集半枝蓮具有抗腫瘤作用的黃酮成分的最佳方法，以期為半枝蓮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

ME104E 電子天平[精度：0.0001 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；AUX120D 分析天平（精度：0.01 mg）、UV-6780 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（上海秋佐科學(xué)儀器有限公司）；XFB-200 中藥粉碎機(jī)（湖南省吉首市中州機(jī)械廠）；安捷倫1220 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；DHG-9030A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海圣科儀器設(shè)備有限公司）。

色譜乙腈、甲醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；水為自制的重蒸水；HE-802 型大孔吸附樹(shù)脂（上海華震科技有限公司）；木犀草素（純度≥99.6%，批號(hào)：64QB-BHW2）、野黃芩苷（純度≥98%，批號(hào)：L9P5-TK35）、芹菜素（純度≥99.2%，批號(hào)：O5NL-BRWD）對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司）。其他試藥均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

半枝蓮購(gòu)自亳州中藥材市場(chǎng)，產(chǎn)自河北省，經(jīng)江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系張濤教授鑒定為黃芩屬植物半枝蓮Scutellaria barbataD.Don 正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 半枝蓮總黃酮的提取

取適量半枝蓮在烘箱內(nèi)低溫烘干，粉碎，過(guò)60 目篩，精密稱取5.0 g 粉末，加入12 倍量藥材重量的乙醇溶液（φ＝0.7），即180 mL 乙醇（φ＝0.7）水溶液，進(jìn)行超聲提取，超聲功率250 W，超聲溫度為50℃[15]，提取3 次，每次1 h，過(guò)濾，合并提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮回收乙醇，至提取液沒(méi)有醇味，得到半枝蓮提取液30 mL。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 溶劑萃取法富集所得供試品溶液（供試品A 溶液） 依次采用等體積（即30 mL）的石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇溶液萃取“2.1”項(xiàng)下半枝蓮提取液，萃取3 次，合并有機(jī)層，分別得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層。用鹽酸鎂粉反應(yīng)鑒別各有機(jī)溶劑層是否含有黃酮，結(jié)果顯示乙酸乙酯層、正丁醇層呈陽(yáng)性，表明這兩個(gè)有機(jī)層中含有黃酮類化合物。合并乙酸乙酯層與水飽和正丁醇層，回收溶劑，得浸膏0.6230 g。加入適量甲醇溶液，超聲溶解，并用甲醇定容至25 mL。搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液0.5 mL，置于10 mL 量瓶，用甲醇定容，搖勻，即得供試品A 溶液。平行制備若干批，4℃保存，供測(cè)試用。

2.2.2 堿提酸沉法富集所得供試品溶液（供試品B 溶液） 取“2.1”項(xiàng)下半枝蓮總黃酮提取液，加入飽和氫氧化鈣水溶液以調(diào)節(jié)溶液pH 至8 ～9，然后加入濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH 至4 ～5[16]，靜置后抽濾，所得固體水洗至中性，低溫烘干，得浸膏0.1845 g。加入適量甲醇溶液，超聲溶解，并用甲醇定容至25 mL。搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液0.5 mL，置于10 mL 量瓶，用甲醇定容，搖勻，即得供試品B 溶液。平行制備若干批，4℃保存，供測(cè)試用。

2.2.3 大孔吸附樹(shù)脂法富集所得供試品溶液（供試品C 溶液） 取適量HE-802 型大孔吸附樹(shù)脂，用95%乙醇溶液浸泡24 h，使大孔吸附樹(shù)脂充分溶脹，倒出乙醇及漂浮物后，濕法裝柱，用乙醇溶液（φ＝0.95）洗滌樹(shù)脂，直至層析柱流出液加入蒸餾水（1∶1，V/V）后不呈白色渾濁狀，再用去離子水洗至流出液澄清并且沒(méi)有醇味后備用，計(jì)算柱床體積為80 mL；將“2.1”項(xiàng)下半枝蓮總黃酮提取液沿壁緩緩加入層析柱中，吸附1 h 后，用2 BV（160 mL）水洗2 次，流速為2 mL·min－1，待水滴完后，再使用2 BV（160 mL）乙醇（φ＝0.2）溶液洗脫雜質(zhì)，流速為2 mL·min－1，用2 BV（160 mL）的乙醇（φ＝0.5）溶液洗脫總黃酮[11，17]，流速為2 mL·min－1，每流份為0.5 BV，同時(shí)，對(duì)所得流份用鹽酸鎂粉反應(yīng)進(jìn)行鑒別，合并陽(yáng)性反應(yīng)流份，回收溶劑，得浸膏0.2336 g。浸膏加入適量甲醇溶液，超聲溶解，并用甲醇定容至25 mL。搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液0.5 mL，置于10 mL 量瓶，用甲醇定容，搖勻，即得供試品C 溶液。平行制備若干批，4℃保存，供測(cè)試用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取木犀草素、野黃芩苷、芹菜素對(duì)照品適量，置于量瓶中，用甲醇溶解并定容至25 mL，搖勻，配制得到含野黃芩苷272.02 μg·mL－1、木犀草素261.34 μg·mL－1、芹菜素248.03 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 色譜條件

色譜柱：GALAK EF-C18M 色譜柱；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～5 min，20% A；5 ～20 min，20%～28%A；20 ～30 min，28 ～30% A；30 ～35 min，30% ～35%A；35 ～50 min，35% ～60% A；50 ～51 min，60%～90% A；51 ～60 min，90% A）；流速：0.8 mL·min－1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及專屬性試驗(yàn)

分別精密量取“2.2”供試品溶液和“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行含量測(cè)定，記錄其色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖1可知，野黃芩苷保留時(shí)間為13.580 min，木犀草素保留時(shí)間為31.274 min，芹菜素保留時(shí)間為40.630 min，其分離度均大于1.5，表明在此色譜條件下3 種黃酮類化合物能有效分離，其他成分無(wú)干擾。

圖1 4 種溶液的HPLC 色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of 4 solution

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋成一系列濃度梯度的混合對(duì)照品溶液。采用“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄峰面積。分別以野黃芩苷、木犀草素、芹菜素的峰面積為Y軸，質(zhì)量濃度為X（μg·mL－1）軸建立回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，野黃芩苷、木犀草素、芹菜素在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

表1 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 1 Regression equation and related coefficient

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.6”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，測(cè)得野黃芩苷、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD值分別為0.32%、0.18%、0.21%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液6 份，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)得野黃芩苷、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD值分別為1.5%、1.1%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在室溫下靜置0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得野黃芩苷、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD值分別為1.7%、1.3%、1.6%，表明樣品中3 種黃酮單體成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知野黃芩苷、木犀草素、芹菜素含量的同一半枝蓮粉末27 份，每份2.5 g，精密加入相當(dāng)于樣品含量80%、100%和120%（按3 種富集總黃酮方法所得各自的成分含量結(jié)果計(jì)算）的野黃芩苷、木犀草素、芹菜素對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下方法提取，按“2.2”項(xiàng)下各富集方法制得供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。3 種提取方法所得野黃芩苷、木犀草素、芹菜素平均回收率均＞100.0%，RSD均＜1.0%（n＝3）。

2.11 不同富集方法所得樣品的含量測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下3 種樣品各約5.0 g，平行3 份，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中野黃芩苷、木犀草素、芹菜素的含量及三者之和的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。采用溶劑萃取法得到總黃酮浸膏0.6203 g（n＝3），產(chǎn)率為12.41%（n＝3）；采用堿提酸沉法得到總黃酮浸膏0.1845 g（n＝3），產(chǎn)率為3.69%（n＝3）；采用大孔樹(shù)脂吸附法得到總黃酮浸膏0.1869 g（n＝3），產(chǎn)率為3.74%（n＝3）。其中，溶劑萃取法富集得到的總黃酮浸膏量最大，堿提酸沉法和大孔樹(shù)脂法富集的總黃酮浸膏差別不大。從表2中可知，堿提酸沉法所富集的總黃酮含量（以野黃芩苷、木犀草素、芹菜素的含量之和計(jì)）最高，達(dá)到92.6773 mg。

表2 3 種不同方法所富集總黃酮的含量測(cè)定結(jié)果(n ＝3，mg·g－1)Tab 2 Content determination of total flavonoids enriched by 3 different methods (n ＝3，mg·g－1)

利用SPSS 22.0 軟件對(duì)3 種不同富集方法所得總黃酮中野黃芩苷、木犀草素、芹菜素的含量分別進(jìn)行單因素ANOVO 統(tǒng)計(jì)分析，同一成分在不同組間的平均值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），表明不同的富集方法得到的黃酮成分的含量存在非常顯著的差異。其中堿提酸沉法富集所得總黃酮浸膏中野黃芩苷、木犀草素、芹菜素含量均是最高的，總黃酮含量也最高。

3 討論

本試驗(yàn)采用超聲提取法提取半枝蓮，采用不同方法（溶劑萃取法、堿提酸沉法、大孔樹(shù)脂吸附法）富集半枝蓮總黃酮。利用高效液相色譜法，以抗腫瘤活性較好的單體成分木犀草素、野黃芩苷、芹菜素等含量之和為總黃酮含量指標(biāo)，考察了3 種富集抗腫瘤活性黃酮成分的方法，結(jié)果最好的方法為堿提酸沉法。

本試驗(yàn)分別考察了GALAK EF-C18M（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent Zorbax C18（4.6 mm× 250mm，5 μm）和YMC-Pack C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色譜柱對(duì)樣品中成分分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GALAK EF-C18M（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱對(duì)木犀草素、野黃芩苷、芹菜素分離效果最好，因此選用其作為本試驗(yàn)的色譜柱。

分別考察了0.5、0.8、1.0 和1.2 mL·min－14 種不同流速對(duì)樣品中成分分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.8 mL·min－1時(shí)，主峰的分離度好且分析時(shí)間較合理，因此本試驗(yàn)選用0.8 mL·min－1作為流速。

在本試驗(yàn)中，大孔吸附樹(shù)脂法富集所得總黃酮中芹菜素的含量較低，可能和芹菜素在半枝蓮中含量本來(lái)不高，且在3 個(gè)化合物中其極性最小，導(dǎo)致洗脫不徹底以及鹽酸鎂粉檢測(cè)時(shí)溶液中含量低，檢測(cè)未顯色，未計(jì)算這部分含量有一定關(guān)系。