醋酸潑尼松片在中國人體內(nèi)的藥動學(xué)研究

李庚喜，劉麗芳，李良，劉海艷，周亞麗，楊柳，鄧倩，丁勁松（1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長沙 410000；2.邵陽學(xué)院，湖南 邵陽 422000；.長沙晶易醫(yī)藥科技有限公司，長沙 410205）

潑尼松是1954年合成的一種糖皮質(zhì)激素藥物[1]。它本身沒有生理活性，在體內(nèi)酶的催化作用生成潑尼松龍而產(chǎn)生藥理效應(yīng)[2-4]。潑尼松和潑尼松龍是一對可逆代謝藥物[5]，見圖1。它們廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于各種急性嚴(yán)重細(xì)菌感染、嚴(yán)重過敏性疾病、膠原性疾病、風(fēng)濕病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[6-9]。

圖1 醋酸潑尼松、潑尼松、潑尼松龍體內(nèi)轉(zhuǎn)化圖Fig 1 In vivo transformation of prednisone acetate，prednisone and prednisolone

醋酸潑尼松，為白色或類白色結(jié)晶性粉末，是潑尼松的醋酸酯類藥物，屬國內(nèi)特有品種。微溶于乙醇或氯仿，幾乎不溶于水[10]。研究證實，潑尼松成醋酸酯后，電子云密度增加，從而增加了潑尼松穩(wěn)定性。醋酸酯潑尼松更容易被胃腸道吸收，在體內(nèi)能夠快速水解[11-12]。經(jīng)文獻調(diào)研，醋酸潑尼松在中國人體內(nèi)轉(zhuǎn)化過程，吸收速度及吸收程度尚不清楚；與相同劑量（同摩爾）的潑尼松龍片在人體內(nèi)吸收總量（暴露量）尚不明確；中國境內(nèi)的醋酸潑尼松片說明書的藥動學(xué)尚不完整，不能滿足臨床使用過程的劑量調(diào)整和劑量變化的需要。因此，闡明醋酸潑尼松片在體內(nèi)的吸收代謝變化規(guī)律，并將其與潑尼松龍進行比較是一件具有重要意義的事情。本文研究了醋酸潑尼松片在中國健康人群的藥動學(xué)特點，并比較醋酸潑尼松片和潑尼松龍片兩者在體內(nèi)的暴露量情況。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD XR、島津8050（日本島津公司）；SQP/SECURA225D 分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；XW-80A 微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠）；海爾超低溫保存箱（青島海爾特種電器有限公司）；臺式高速冷凍離心機TGL 18（長沙英泰儀器有限公司）；超純水儀GZY-Y40（湖南科爾頓水務(wù)有限公司）；超聲波清洗器KQ-250（昆山美美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

醋酸潑尼松片（山東新華制藥股份有限公司，批號：2005402，規(guī)格：5 mg/片）；潑尼松龍片（Pfizer AB，批號：X32041，規(guī)格：5 mg/片）；潑尼松龍對照品（PNSL）（批號：100153-201405，含量：99.5%）、潑尼松對照品（PNS）（批號：100199-201503，含量：99.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；內(nèi)標(biāo)潑尼松龍-d8（PNSL-d8）（Toronto Research Chemicals，批號：15-UPA-67-5，純度：97.71%）；甲醇（HPLC 級，Merck）；甲酸（HPLC級，ACS）。

2 方法與結(jié)果

2.1 血漿中潑尼松與潑尼松龍測定方法的建立

2.1.1 LC-MS/MS 測定條件 色譜條件：分析柱為 ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×75 mm，1.8μm）；流動相A 相為含 0.1% 甲酸水溶液，B 相為甲醇；采用梯度洗脫（0 ～2.60 min，59%B；2.60 ～2.70 min，59% ～95%B；2.70 ～3.50 min，95%B；3.50 ～3.60 min，95% ～59%B；3.6 ～5.0 min，59%B）。流速：0.300 mL·min－1；柱溫為40℃；進樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源（ESI源），正離子方式檢測，分析模式質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），接口溫度250℃、DL 管溫度250℃、加熱塊溫度350℃、霧化氣流量3.00 mL·min－1、加熱氣流量10 mL·min－1、干燥氣流量10 mL·min－1。待測物和內(nèi)標(biāo)MRM 檢測的定量離子反應(yīng)為：m/z361.20 →147.00（PNSL）、m/z359.10 →147.00（PNS）、m/z369.05 → 151.10（內(nèi)標(biāo)PNSL-d8），如圖2。

圖2 子離子掃描圖Fig 2 Mass spectrometry

2.1.2 溶液配制

① 精密稱量PNSL 對照品約10.00 mg，經(jīng)校正因子折算后，加入適量甲醇震蕩混勻，配制成含PNSL 10.00 mg·mL－1的儲備液。－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

② 精密稱量PNS 對照品約10.00 mg，經(jīng)校正因子折算后，加入適量甲醇震蕩混勻，配制成含PNS 5.000 mg·mL－1的儲備液。－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

③ 將PNSL 和PNS 儲備液按比例混合，并用50%甲醇水（V/V）逐級稀釋至標(biāo)準(zhǔn)系列溶液所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和質(zhì)控工作液。－20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

④ 以PNSL-d8 作為內(nèi)標(biāo)，用甲醇（含0.01%甲酸）稀釋至5.000 ng·mL－1，儲存在2 ～8 ℃，備用。

2.1.3 血漿樣品處理方法 用人混合血漿新鮮配制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液；用移液器分別精密移取血漿樣本100 μL 至相應(yīng)的96 孔板中；各孔中加入300 μL 內(nèi)標(biāo)溶液（5.000 ng·mL－1），渦旋5 min，2480×g、4℃離心10 min；轉(zhuǎn)移150 μL 上清液至96 孔板中加50.0 μL 蒸餾水稀釋；充分混勻，用錫箔紙封膜后放入自動進樣器或2 ～8℃冰箱準(zhǔn)備進樣。

2.1.4 稀釋驗證樣品處理 取10.0 μL 質(zhì)控工作液，加入190 μL 空白血漿，配制成含PNSL/PNS（500.0/200.0 ng·mL－1）人血漿樣品后，再用空白基質(zhì)稀釋10 倍，精密移取稀釋后的血漿樣品100 μL，按照“2.1.3”項下方法制得。

2.2 方法學(xué)驗證[12-14]

2.2.1 專屬性考察 取“2.1.2”項下溶液，在“2.1.1”項條件下進樣測定，記錄色譜圖（見圖3）。PNSL、PNS 和內(nèi)標(biāo)PNSL-d8 的保留時間分別為2.05、1.65、2.00 min，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾藥物和內(nèi)標(biāo)的測定，由圖分析可知，基質(zhì)成分不干擾目標(biāo)物的測定，本試驗方法選擇性強。

圖3 典型色譜圖Fig 3 Typical chromatogram

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

① PNSL 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y＝0.096x＋0.018（r2＝0.9992），線性范圍為1.000 ～200.0 ng·mL－1，定量限為1.000 ng·mL－1，連續(xù)測定6 個定量限樣本，準(zhǔn)確度為106.90%，RSD為8.5%。

② PNS 標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y＝0.070x－0.057（r2＝0.9991），線性范圍為0.4000 ～80.00 ng·mL－1，定量限為0.4000 ng·mL－1，連續(xù)測定6 個定量限質(zhì)量濃度樣本，計算準(zhǔn)確度為102.4%，RSD為11%。

2.2.3 精密度和方法回收率 按照表1配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，各平行6 份，按“2.1”項下方法測定，結(jié)果方法精密度與方法回收率良好，符合生物樣品分析要求，見表1。

表1 潑尼松、潑尼松龍在人血漿中批間和批內(nèi)精密度、準(zhǔn)確度Tab 1 Precision and accuracy of prednisone and prednisolone in human plasma in inter and intra assay

2.2.4 穩(wěn)定性 儲備液（甲醇）在室溫條件4.5 h 內(nèi)穩(wěn)定；工作液（50%甲醇水，V/V）在室溫6 h 穩(wěn)定；基質(zhì)樣品前處理6 h 穩(wěn)定、凍融循環(huán)5 次穩(wěn)定、自動進樣器條件（約5℃）存放113 h 穩(wěn)定、－80℃存放100 d 穩(wěn)定，見表2。

2.2.5 基質(zhì)效應(yīng) 通過試驗發(fā)現(xiàn)，內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)符合要求。6 個不同來源的基質(zhì)經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果顯示PNSL 的LQC（質(zhì)控低濃度，3.000 ng·mL－1）、MQC（質(zhì)控中濃度，15.00 ng·mL－1）和HQC（質(zhì)控高濃度，150.0 ng·mL－1）樣品的變異系數(shù)分別為1.42%、3.31%和1.15%。PNS 的LQC（1.200 ng·mL－1）、MQC（6.000 ng·mL－1）和HQC（60.00 ng·mL－1）樣品的變異系數(shù)（CV）分別為4.20%、4.23%和3.23%。均小于15%，符合9012 法規(guī)生物樣本檢測的規(guī)定。

2.3 醋酸潑尼松片與潑尼松龍片藥動學(xué)比較研究

該項試驗方案經(jīng)中南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[批件號為2018 倫審第（21）號]，研究嚴(yán)格遵守世界醫(yī)學(xué)會制定《赫爾辛基宣言》的有關(guān)倫理準(zhǔn)則。本試驗入組健康受試者16例，其中男性15例，女性1例，年齡在19 ～39 歲，體質(zhì)量在45.0 ～83.7 kg，BMI 在（22.08±2.45）kg·m－2。所有受試者均充分了解試驗方案和過程，并簽署知情同意書。

2.3.1 給藥與血樣采集 受試者于試驗前1日晚上入住病房，禁食10 h 以上。試驗當(dāng)日早上8：00 ～8：16 在研究人員的監(jiān)督下，在坐姿下空腹單次口服對照制劑（R）潑尼松龍片1 片（5 mg）或受試制劑（T）醋酸潑尼松片1 片（5 mg），用240 mL 水送服，服藥前后1 h 內(nèi)禁止飲水（服藥時的240 mL 水除外），服藥4 h 內(nèi)禁食。雙周期試驗，每周期內(nèi)各8 人。分別于給藥前（0 h）及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24 h 采集靜脈血各4 mL 置于預(yù)冷的肝素鈉抗凝采血管中。全血樣品采集后60 min 內(nèi)離心（4℃、2000 g 離心10 min）備存。

表2 基質(zhì)樣品穩(wěn)定性(n ＝6)Tab 2 Stability of matrix samples (n ＝6)

2.3.2 醋酸潑尼松片體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù) 16 名健康受試者單次口服5 mg 醋酸潑尼松片與潑尼松龍片后，按照“2.3.1”項下方法采集血樣，按“2.1”項下方法測定，主要藥動學(xué)參數(shù)見表3和表4。

表3 空腹服用醋酸潑尼松片與潑尼松龍片的血漿中潑尼松平均藥動學(xué)參數(shù)比較(n ＝16)Tab 3 Mean pharmacokinetic parameters of prednisone in plasma after administration of prednisone acetate tablets and prednisolone tablets on empty stomach (n ＝16)

表4 空腹服用醋酸潑尼松片與潑尼松龍片的血漿中潑尼松龍平均藥動學(xué)參數(shù)比較 (n ＝16)Tab 4 Mean pharmacokinetic parameters of prednisolone in plasma after administration of prednisone acetate tablets and prednisolone tablets on empty stomach (n ＝16)

2.3.3 醋酸潑尼松片與潑尼松片體內(nèi)藥動學(xué)曲線

16 名健康受試者單次口服5 mg 醋酸潑尼松片或潑尼松龍片，平均血藥濃度-時間曲線如圖4。

圖4 潑尼松龍和潑尼松平均血藥濃度Fig 4 Mean blood concentration curve of prednisolone and prednisone

2.3.4 醋酸潑尼松片和潑尼松龍片體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)統(tǒng)計分析 醋酸潑尼松在體內(nèi)經(jīng)過代謝生成有藥理作用的活性物質(zhì)潑尼松龍，其中醋酸潑尼松的分子量為400.47，潑尼松龍的分子量為360.45。雖然醋酸潑尼松片和潑尼松龍片給藥劑量均是5 mg，但其物質(zhì)的量并不相同，即使醋酸潑尼松100%轉(zhuǎn)化，也只相當(dāng)于給藥潑尼松龍4.5 mg。采用Winnonlin 8.1 統(tǒng)計學(xué)軟件進行結(jié)果統(tǒng)計，并對結(jié)果進行分子量折算，結(jié)果見表5和表6。

表5 醋酸潑尼松片折算后血漿中潑尼松龍藥動學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計分析(n ＝16)Tab 5 Statistical analysis of prednisolone pharmacokinetics parameters in plasma after conversion of prednisone acetate tablets (n ＝16)

表6 醋酸潑尼松片折算后血漿中潑尼松藥動學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計分析(n ＝16)Tab 6 Statistical analysis of prednisone pharmacokinetics parameters in plasma after conversion of prednisone acetate tablets (n ＝16)

經(jīng)過折算后潑尼松龍藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的幾何均值比值分別為96.17%、99.17%、99.66%，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分 別 為87.73% ～105.42%、95.90% ～102.55%、96.19% ～103.27%；潑尼松藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的幾何均值比值分別為105.27%、101.65%、101.88%，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為98.88%～112.09%、97.54%～105.94%、97.90%～106.02%。

3 結(jié)論與討論

3.1 血漿中潑尼松與潑尼松龍測定方法的建立

文獻報道檢測PNS、PNSL 濃度方法，主要有HPLC 法、LC-MS/MS 法、UPLC-MS/MS 和GC-MS 法等[15-19]。本研究使用的LC-MS/MS 法測定醋酸潑尼松片體內(nèi)藥動學(xué)數(shù)據(jù)，同時檢測人血漿中的PNS 和PNSL 濃度，采用蛋白沉淀法，在甲醇-0.1%甲酸水做流動相條件下，梯度洗脫法可確保待測樣品完全分離，耗時短，靈敏度高，可滿足高通量同時測定PNS 及代謝產(chǎn)物PNSL 的要求。

3.2 醋酸潑尼松片與潑尼松龍片藥動學(xué)比較研究

對醋酸潑尼松片與潑尼松龍片主要藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～t、AUC0～∞等進行統(tǒng)計學(xué)分析，經(jīng)過折算后的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信區(qū)間均在在可接受范圍內(nèi)（80%～120%）。這說明醋酸潑尼松片在消化道的降解是迅速而完整的，同時由于血漿中PNS 和PNSL 分別等效，說明醋酸潑尼松片與相同劑量（摩爾數(shù)）的潑尼松龍片具有生物等效性，醋酸潑尼松片完全可以替換潑尼松龍片。但是醋酸潑尼松吸收的詳細(xì)情況特別是食物對醋酸潑尼松片藥動學(xué)的影響有待進一步考證。