超濾-高效液相色譜法研究米卡芬凈對頭孢曲松血漿蛋白結合率的影響

吳瑕，馬穎超，劉秀菊，楊秀嶺，董維沖，殷立新（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院藥學部，石家莊 050000）

頭孢曲松為第三代頭孢菌素，對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌等革蘭氏陰性菌，及甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等革蘭氏陽性菌均具有良好抗菌活性[1]。棘白菌素類抗真菌藥，用于治療曲霉菌屬、念珠菌屬等引起的深部真菌感染[2]。臨床治療病原菌不明的嚴重感染時常需聯合使用抗細菌、真菌藥物以求對致病菌的廣覆蓋[3]，頭孢曲松與米卡芬凈聯合應用可作為一種抗感染治療方案應用于臨床。

頭孢曲松和米卡芬凈具有相似的藥動學（pharmacokinetics，PK）特征，血漿蛋白結合率（plasma protein binding，PPB）高、表觀分布容積小、半衰期長[4]，高PPB 的藥物合用可能因競爭血漿蛋白而增加游離型藥物濃度，同時也增加表觀分布容積[5]，使藥物PK 發(fā)生改變。目前國內外尚無兩藥合用時頭孢曲松PPB 變化的報道，本試驗采用超濾-高效液相色譜法測定正常人血漿中頭孢曲松的游離藥物濃度及PPB，并進一步考察米卡芬凈對頭孢曲松體外PPB 的影響。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（配2489 型紫外檢測器），Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；超濾離心管（0.5 mL，10 kD，美國 Millipore公司）；離心機（ABBOTT，德國）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學儀器廠）；低溫冰箱（MDF-U2086S，日本三洋）；冷藏柜（YC-180，澳柯瑪）；電子分析天平（CPA225D，德國 Sartorius）；pH 計（pH213，意大利 HANNA）。

1.2 試藥

頭孢曲松對照品（批號：130480-201704，含量：83.9%）、內標頭孢呋辛對照品（批號：130493-201706，含量：91.9%）（中國食品藥品檢定研究院）；注射用米卡芬凈鈉（批號：027880，Astellas Pharma Tech Co.，Ltd.Takaoka Plant）；人血漿由河北省血液中心提供；乙腈（分析純，賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.03 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液（12∶88，V/V，三乙胺調pH 7.5）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的配制

① 分別精密稱取頭孢曲松、米卡芬凈鈉11.92 mg、25 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用水溶解定容，配制成1 mg·mL－1頭孢曲松對照品溶液、2.5 mg·mL－1米卡芬凈藥品溶液，4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

② 精密稱取內標頭孢呋辛對照品10.88 mg置于50 mL 量瓶中，用水溶解定容，配制成200 μg·mL－1內標溶液，4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理

2.3.1 游離型藥物濃度測定的樣本處理 取血漿500 μL 加入到超濾離心管內管中，室溫12 639 r·min－1離心10 min，棄去超濾液，將內管中的血漿加至500 μL，重復上述操作1 次，取超濾液進行分析。

2.3.2 總血藥濃度測定的樣本處理 參考文獻[6]的方法并進行改良，于1.5 mL 離心管中加入200 μL 血漿及20 μL 內標頭孢呋辛溶液，加入300 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，13 000 r·min－1離心10 min，取上清液進行分析。

2.4 方法專屬性

取人空白血漿、人空白血漿＋頭孢曲松對照品＋注射用米卡芬凈鈉、人空白血漿＋頭孢曲松對照品＋內標頭孢呋辛對照品，分別按“2.3.1”項下方法處理后進行分析并記錄色譜圖。頭孢曲松和內標的保留時間分別為7.36 min、20.41 min，峰形良好，米卡芬凈在監(jiān)控時間30 min 內未洗脫，人血漿中的內源物質不干擾測定，結果見圖1。

圖1 頭孢曲松高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of ceftriaxone

2.5 方法學考察

2.5.1 游離型藥物濃度測定 用人空白血漿超濾液逐步稀釋頭孢曲松對照品溶液，制得質量濃度為0.5、1、5、10、20、50、100 μg·mL－1系列樣品溶液進行分析。以質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）作線性回歸分析（權重因子1/c2），標準曲線方程為y＝2.18×104x－4.45×103，r＝0.9999，表明頭孢曲松游離質量濃度在0.5 ～100 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。檢測限（S/N＝3）為0.05 μg·mL－1，定量限（S/N＝10）為0.1 μg·mL－1。

2.5.2 總血藥濃度測定 將不同質量濃度的頭孢曲松對照品溶液置于1.5 mL 離心管中常溫氮氣吹干，加入空白血漿，制成質量濃度為5、10、50、100、200、500 μg·mL－1的頭孢曲松血漿樣品，按“2.3.2”項下方法處理，取上清液進行分析。以待測物質量濃度為橫坐標（x），待測物與內標物峰面積比值為縱坐標（y）作線性回歸分析（權重因子1/c2），標準曲線方程為y＝0.0539x＋0.0463，r＝0.9998，表明頭孢曲松總質量濃度在5 ～500 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。

2.5.3 精密度試驗 取人空白血漿超濾液配制低、中、高質量濃度（1、10、80 μg·mL－1）的頭孢曲松對照品溶液各5 份，在1 d 內分析，按隨行標準曲線計算日內精密度；再連續(xù)5 d 分析，計算日間精密度。結果低、中、高濃度日內精密度RSD分別為1.6%、2.4%和 2.1%，日間精密度RSD分別為1.9%、2.9%和 2.7%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取人空白血漿配制低、中、高質量濃度（10、200、400 μg·mL－1）的頭孢曲松血漿樣品各5 份，渦旋混勻，37 ℃水浴0.5 h，按“2.3.2”項下方法處理后4℃冰箱放置0、1、2、4 h 后進行測定，考察處理后4℃放置穩(wěn)定性；血漿樣品于－40℃冰箱低溫保存5 d，考察低溫保存穩(wěn)定性；血漿樣品反復凍融3 次，考察反復凍融穩(wěn)定性。結果RSD均＜10%，表明在上述條件下相關樣品均穩(wěn)定。

2.5.5 超濾膜回收率 將低、中、高質量濃度（1、10、80 μg·mL－1）的頭孢曲松對照品溶液進行超濾離心，考察超濾離心次數對超濾膜回收率的影響。試驗表明經1 次超濾離心后待測物的回收率還較低（低、中、高濃度分別為86.40%、83.26%、82.89%）；經2 次超濾離心后待測物的回收率提高（低、中、高濃度分別為97.09%、95.64%、96.82%），第3 次超濾離心回收率無明顯增加（低、中、高濃度分別為98.52%、95.43%、97.01%），因此確定經2 次超濾離心后的超濾液用于分析，非特異性吸附造成的待測物濃度損失可忽略。

2.5.6 平衡時間的考察 用人空白血漿配制低、中、高質量濃度（10、100、300 μg·mL－1）的頭孢曲松血漿樣品，渦旋混勻，37 ℃水浴0.5、1、1.5、2 h，考察頭孢曲松與血漿白蛋白達到平衡所需的時間。結果表明37 ℃水浴0.5 h 頭孢曲松游離濃度維持穩(wěn)定。

2.5.7 超濾離心時間的考察 以不漏蛋白且超濾液體積與超濾前血漿總體積的比值在0.3 ～0.6 為標準[7]，考察最佳的超濾離心條件為室溫12 639 r·min－1，離心10 min。

2.6 米卡芬凈對頭孢曲松PPB 的影響

配制100、300、500 μg·mL－1的頭孢曲松血漿樣品，渦旋混勻，37℃水浴0.5 h，每個質量濃度分別取適量按照“2.3.2”項下方法測定總血藥濃度（Ct），剩余血漿按照“2.3.1”項下方法測定游離濃度（Cf），計算頭孢曲松PPB ＝[（Ct－Cf）/Ct]×100%。

在上述血漿樣品中加入不同質量濃度的注射用米卡芬凈鈉溶液，得到約含2、10、20 μg·mL－1米卡芬凈的頭孢曲松血漿樣品，考察米卡芬凈對頭孢曲松PPB 的影響。

用SPSS 20.0 軟件配對樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析，結果發(fā)現，隨著血漿中頭孢曲松濃度的升高，其體外PPB 下降明顯（P＜0.05）。低、中、高質量濃度（2、10、20 μg·mL－1）米卡芬凈對頭孢曲松的PPB 均無顯著影響。結果見表1。

表1 米卡芬凈對頭孢曲松PPB 的影響(n ＝3)Tab 1 Effect of micafungin on the plasma protein binding rate of ceftriaxone (n ＝3)

3 討論

頭孢曲松為親水性抗菌藥物，不易透過脂質細胞膜，主要分布于血液和體液中，PPB 約為85%～95%，評價該藥的藥動/藥效學指數為抗菌藥物游離濃度超過最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的時間（time，T）占給藥間隔的比率，即f%T＞MIC[8]，因為只有游離型藥物才能從血液向組織中轉運，在感染部位發(fā)揮抗菌作用。當患者處于某些特殊病生理狀態(tài)時，如低蛋白血癥、肝炎、肝硬化、尿毒癥、腎病綜合征等，PPB 會發(fā)生改變而影響游離藥物濃度[9]。本研究建立了超濾-高效液相色譜法測定頭孢曲松游離藥物濃度，較傳統(tǒng)的平衡透析法操作簡單、耗時短，可用于臨床樣本的測定。

超濾離心管濾膜孔徑的選擇，頭孢曲松主要與人血清白蛋白（HSA）結合，白蛋白分子量為66.3 kD，選擇常用的截留分子量為10 kD 的超濾離心管可滿足測定要求。

頭孢曲松在體內不被代謝，試驗測定無需考慮代謝產物的影響。健康人群靜脈滴注頭孢曲松0.5、1、2 g，穩(wěn)態(tài)時Cmax分別為80、150、250 μg·mL－1，臨床治療中度敏感菌引起的感染或細菌性腦膜炎時，單次劑量最大可給予4 g，因此本研究考察了頭孢曲松血藥濃度為100、300、500 μg·mL－1時的PPB 值。有研究給予健康人群靜脈滴注米卡芬凈50、100、150 mg，Cmax分別為2.68、5.53、8.26 μg·mL－1，臨床治療嚴重或難治性曲霉菌病時單次劑量可增至300 mg，Cmax與給藥劑量基本呈線性關系[10]，因此本研究考察了2、10、20 μg·mL－1米卡芬凈對不同濃度頭孢曲松PPB 的影響。

頭孢曲松可在HSA 的位點Ⅰ（華法林結合位點）上通過氫鍵和范德華力可逆性結合[11]，且結合具有飽和性，隨著藥物濃度增加，蛋白上的結合位點趨于飽和，導致游離藥物比率加大，本試驗也驗證了隨著頭孢曲松血藥濃度的升高PPB明顯下降，但下降幅度與 Perry 等[12]報道的隨著頭孢曲松血清濃度從0.5 mg·L－1升高至300 mg·L－1，游離部分從4%增加到17%存在一定差異。由于體外試驗無法完全模擬藥物在體內分布和消除的動態(tài)過程，需進一步開展體內研究。

試驗證明米卡芬凈對頭孢曲松PPB 影響小，僅可使高濃度頭孢曲松的PPB 下降約4%，這是因為頭孢曲松結合常數（Ka）大，為3.67×104M－1[13]，與HSA 的結合能力強，不易被米卡芬凈置換；頭孢曲松治療窗較寬，安全性好，推測兩藥合用時不會因為頭孢曲松游離濃度的少量升高而引起不良反應，但這一結論仍有待臨床進一步觀察驗證。