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      尾靜脈注射BA/F3-JAK2V617F細(xì)胞構(gòu)建BALB/c小鼠真性紅細(xì)胞增多癥模型

      2021-05-06 07:35:50石鎮(zhèn)港夏偉劉學(xué)武馮璐瑤馮超趙丞姜德建信紅亞湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地長沙41008湖南省藥物安全評價研究中心新藥藥效與安全評價湖南省重點實驗室長沙410331中南大學(xué)湘雅醫(yī)院血液科長沙410008
      中南藥學(xué) 2021年4期
      關(guān)鍵詞:胸骨脾臟空白對照

      石鎮(zhèn)港,夏偉,劉學(xué)武,馮璐瑤,馮超,趙丞,姜德建,信紅亞(1.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地,長沙 41008;.湖南省藥物安全評價研究中心,新藥藥效與安全評價湖南省重點實驗室,長沙 410331;3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院血液科,長沙 410008)

      真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemia vera,PV)是一種Ph 陰性骨髓增生性腫瘤疾病,其全球性群體發(fā)病率為8.4×10-6[1]。PV 的主要特征為二系或三系骨髓細(xì)胞過度增殖,臨床表現(xiàn)為以紅細(xì)胞計數(shù)升高為主的二系或三系血細(xì)胞計數(shù)升高,通常伴有肝脾腫大、出血與血栓形成,末期可進展為骨髓纖維化疾病[2]。隨著JAK2V617F基因突變的發(fā)現(xiàn),研究者對PV 的發(fā)病機制有了更深的了解,目前PV 患者中約95%存在JAK2V617F或JAK2外顯子12 號基因突變[3-4]。現(xiàn)階段研究人員主要是通過轉(zhuǎn)基因、基因敲入或注射轉(zhuǎn)染JAK2V617F突變基因細(xì)胞等方法構(gòu)建JAK2V617F突變的PV 疾病動物模型[5-8]。與注射轉(zhuǎn)染JAK2V617F突變基因細(xì)胞方法相比,轉(zhuǎn)基因及基因敲入建立PV 模型存在耗時長、成本較高等缺點,因此本研究采用尾靜脈注射JAK2V617F突變細(xì)胞,構(gòu)建BALB/c 小鼠PV 模型,模擬PV 全身播散的生物學(xué)特點,探討PV 模型建立方法以及細(xì)胞量對PV 動物模型建立的影響,為今后研究PV 治療提供模型基礎(chǔ)。

      1 材料

      1.1 實驗動物及預(yù)處理

      SPF 級BALB/c小鼠40只,雌性,5 ~6 周齡[湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2011-0003;飼養(yǎng)于湖南省藥物安全評價研究中心屏障環(huán)境,實驗動物使用許可證號:SYXK(湘)2015-0016]。所購小鼠于SPF 級動物房內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)1 周,標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼養(yǎng),飲水、墊料及一切與鼠接觸的物品均經(jīng)滅菌處理。接種前動物接受1.0 Gay 劑量的全身輻照,預(yù)處理后24 h 內(nèi)尾靜脈接種細(xì)胞。

      1.2 試藥與儀器

      BA/F3 完全培養(yǎng)基、BA/F3 細(xì)胞(上海復(fù)祥生物科技有限公司);JAK2V617F質(zhì)粒(載體為pCDH-CMV-MCS-COpGFP-T2A-Puro)、空白載體質(zhì)粒及慢病毒(武漢中邁盈科生物科技有限公司構(gòu)建并包裝);磷酸蘆可替尼片(AG,規(guī)格:5 mg/片,批號:SCU66);BC-5800 型五分類血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞公司);ME2002E 型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];RM2235 型石蠟切片機、TP1020 型全自動脫水機、ED1150H +C 型組織包埋機、DFC420C 病理成像系統(tǒng)、DM2000 型生物顯微鏡(德國Leica 公司)。

      2 方法

      2.1 實驗分組及給藥方法

      BA/F3 細(xì)胞復(fù)蘇后置于含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基(含10 ng·mL-1的白介素3)中,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2 ~3 d 換液傳代一次。收集對數(shù)生長期細(xì)胞分別進行JAK2V617F慢病毒和空白載體質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染,篩選JAK2V617F慢病毒、空白載體質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進行傳代培養(yǎng),細(xì)胞命名為BA/F3-JAK2V617F、BA/F3-Blank。雌性BALB/c 小鼠40只,隨機分為空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、蘆可替尼組,每組8 只。低劑量組、中劑量組、高劑量組、蘆可替尼組分別經(jīng)尾靜脈注射密度為1×106、5×106、8×106、8×106個·mL-1的BA/F3-JAK2V617F細(xì)胞,0.2 mL/只,空白對照組尾靜脈注射密度為8×106個·mL-1的BA/F3-Blank 細(xì)胞,0.2 mL/只,每日將蘆可替尼配制成質(zhì)量濃度為0.26 mg·mL-1的藥液按20 mL·kg-1進行灌胃給藥,空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組給予等體積純水,每日給藥1 次,連續(xù)給藥4 周。

      2.2 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

      采用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計分析,統(tǒng)計學(xué)意義的水平設(shè)定為P≤0.05,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,用Leven’s test 方法檢驗正態(tài)性和方差齊性,如果符合正態(tài)性和方差齊性,用單因素方差分析(ANOVA)和LSD test 進行統(tǒng)計分析;如果不符合正態(tài)性和方差齊性,則用Kruskal-Wallis 檢驗,如果Kruskal-Wallis 檢驗有統(tǒng)計學(xué)意義(P≤0.05),則用Dunnett’s test(非參數(shù)方法)進行比較分析,評價時考慮統(tǒng)計學(xué)差異和生物學(xué)意義。

      2.3 觀察指標(biāo)

      2.3.1 血液學(xué)指標(biāo) 末次給藥后,各組小鼠眼底靜脈叢采血,0.2 mL/只,檢測血液中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞比容(HCT)。

      2.3.2 脾臟質(zhì)量及脾指數(shù) 末次給藥后,各組小鼠頸椎脫臼處死,解剖取脾臟并稱重,按以下公式計算脾指數(shù)。

      脾指數(shù)(mg·g-1)=脾臟濕重(mg)/體質(zhì)量(g)

      2.3.3 骨髓涂片 解剖取胸骨,用鑷子擠壓胸骨,直至擠壓出骨髓,對骨髓進行骨髓涂片,光鏡下觀察有核細(xì)胞計數(shù)變化。

      2.3.4 組織病理學(xué)變化 解剖取脾臟、胸骨、股骨、腰椎,10%福爾馬林固定,作組織病理學(xué)檢查。

      3 結(jié)果

      3.1 血液學(xué)指標(biāo)變化

      如表1所示,與空白對照組比較,低劑量組HGB 明顯升高(P≤0.01),中劑量組、高劑量RBC、HGB、HCT 均明顯升高(P≤0.01),高劑量組RBC、HGB、HCT 顯著高于低劑量組和中劑量組。與高劑量組比較,蘆可替尼組RBC、HGB、HCT 均明顯降低(P≤0.01)。

      表1 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對血液學(xué)指標(biāo)的影響( ±s,n =8)Tab 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the hematology indexes ( ±s,n =8)

      表1 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對血液學(xué)指標(biāo)的影響( ±s,n =8)Tab 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the hematology indexes ( ±s,n =8)

      注:與空白對照組比較,##P ≤0.01;與高劑量組比較,**P ≤0.01。Note:Compared with the blank control group,##P ≤0.01;compared with the high dose group,**P ≤0.01.

      組別 濃度/(個·mL-1) WBC/(×109·L-1) RBC/(×1012·L-1) HGB/(g·L-1) HCT/%空白對照組 8.0×106 8.76±1.17 6.71±0.83 140±11 47.3±4.3低劑量組 1.0×106 8.80±0.91 7.18±1.02** 166±19##** 49.1±3.1**中劑量組 5.0×106 8.56±1.02 10.50±1.88##** 195±14##** 58.3±5.0##**高劑量組 8.0×106 9.19±1.08 12.95±1.54## 222±23## 66.1±6.8##蘆可替尼組 8.0×106 9.28±0.92 6.98±0.85** 149±18** 49.4±5.1**

      3.2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對脾臟質(zhì)量及脾指數(shù)的影響

      如表2及圖1所示,與空白對照組比較,其余各組體質(zhì)量明顯下降(P≤0.05 或P≤0.01),中、高劑量組脾臟質(zhì)量、脾指數(shù)明顯增大(P≤0.01)。與高劑量組比較,低、中劑量組及蘆可替尼組體質(zhì)量均明顯升高(P≤0.01),脾臟質(zhì)量、脾指數(shù)均明顯降低(P≤0.05 或P≤0.01)。

      表2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對體質(zhì)量、脾臟、脾指數(shù)的影響( ±s,n =8)Tab 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the body mass,spleen and spleen index ( ±s,n =8)

      表2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對體質(zhì)量、脾臟、脾指數(shù)的影響( ±s,n =8)Tab 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the body mass,spleen and spleen index ( ±s,n =8)

      注:與空白對照組比較,#P ≤0.05,##P ≤0.01;與高劑量組比較,*P ≤0.05,**P ≤0.01。Note:Compared with the blank control group,#P ≤0.05,##P ≤0.01;compared with the high dose group,*P ≤0.05,**P ≤0.01.

      組別 濃度/(個·mL-1) 體質(zhì)量/g 脾臟質(zhì)量/mg 脾指數(shù)/(mg·g-1)空白對照組 8.0×106 29.5±0.7 163±15 5.5±0.5低劑量組 1.0×106 28.5±1.5#** 175±19** 6.2±0.6#**中劑量組 5.0×106 25.5±1.0##** 202±38##* 7.9±1.5##**高劑量組 8.0×106 21.9±1.0## 225±17## 10.3±0.5##蘆可替尼組 8.0×106 28.0±0.6##** 170±17** 6.1±0.6**

      圖1 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對脾臟的影響Fig 1 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the spleen

      3.3 BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對骨髓中有核細(xì)胞的影響

      如表3所示,與空白對照組比較,其余各組骨髓中粒細(xì)胞系、粒紅比明顯減少(P≤0.05 或P≤0.01),中劑量組、高劑量組、蘆可替尼組紅細(xì)胞系明顯增加(P≤0.05 或P≤0.01)。與高劑量組比較,蘆可替尼組粒紅比明顯增加,紅細(xì)胞系明顯減少(P≤0.01)。

      表3 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對骨髓中有核細(xì)胞的影響( ±s,n =8)Tab 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the nucleated cells in bone marrow ( ±s,n =8)

      表3 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 細(xì)胞對骨髓中有核細(xì)胞的影響( ±s,n =8)Tab 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the nucleated cells in bone marrow ( ±s,n =8)

      注:與空白對照組比較,#P ≤0.05,##P ≤0.01;與高劑量組比較,*P ≤0.05,**P ≤0.01。Note:Compared with the blank control group,#P ≤0.05,##P ≤0.01;compared with the high dose group,*P ≤0.05,**P ≤0.01.

      組別 濃度/(個·mL-1) 粒細(xì)胞系/% 紅細(xì)胞系/% 粒紅比 巨核細(xì)胞/個空白對照組 8.0×106 53.5±2.8 33.5±2.7 1.6±0.2 22.5±2.4低劑量組 1.0×106 48.6±3.9#* 36.3±2.7** 1.3±0.1#** 22.8±2.5中劑量組 5.0×106 45.4±2.7## 41.3±2.7##** 1.1±0.1## 24.8±1.3高劑量組 8.0×106 42.8±6.8## 47.9±7.5## 0.9±0.3## 23.6±2.7蘆可替尼組 8.0×106 46.9±5.2## 38.6±6.3#** 1.3±0.3##** 23.5±2.4

      3.4 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對脾臟、腰椎、股骨、胸骨組織病理學(xué)影響

      如圖2~5 所示,空白對照組小鼠脾臟、腰椎、股骨、胸骨無明顯病理變化;低劑量組脾臟、腰椎、股骨無明顯病理變化,胸骨中骨髓造血活躍,紅系造血細(xì)胞稍增多;中劑量組腰椎無明顯病理變化脾臟髓外造血,紅系造血細(xì)胞明顯增多,胸骨骨髓造血活躍,紅系、粒系造血細(xì)胞均明顯增多;股骨骨髓造血活躍,紅系造血細(xì)胞稍增多,高劑量組脾臟髓外造血,紅系造血細(xì)胞明顯增多,腰椎、股骨、胸骨骨髓造血活躍,紅系、粒系造血細(xì)胞均明顯增多;蘆可替尼組脾臟、股骨、腰椎均無明顯異常,胸骨骨髓造血活躍,紅系造血細(xì)胞稍增多。

      圖2 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對脾臟組織病理學(xué)影響(200×)Fig 2 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the histopathology of the spleen(200×)

      圖3 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對腰椎組織病理學(xué)影響(200×)Fig 3 Effect of different concentrations of BA/F3-JAK2V617F cells on the histopathology of lumbar spine(200×)

      4 討論

      圖4 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對股骨組織病理學(xué)影響(200×)Fig 4 Effect of different BA/F3-JAK2V617F cell concentrations on histopathology of femur(200×)

      圖5 不同濃度BA/F3-JAK2V617F 對胸骨組織病理學(xué)影響(200×)Fig 5 Effect of different BA/F3-JAK2V617F cell concentrations on histopathology of sternum(200×)

      與人類疾病相似性高的動物模型是進行藥效學(xué)與藥理學(xué)研究的實驗基礎(chǔ),腫瘤動物模型建立的首要步驟是防止動物的免疫系統(tǒng)將移植的腫瘤細(xì)胞殺死。本研究采用1.0 Gay 射線全身照射的方式破壞小鼠的免疫系統(tǒng),并在輻照24 h 內(nèi)注射不同濃度的BA/F3-JAK2V617F細(xì)胞建立PV 模型,探索不同濃度的BA/F3-JAK2V617F細(xì)胞對模型建立的影響。研究結(jié)果表明,尾靜脈注射中、高劑量BA/F3-JAK2V617F細(xì)胞后小鼠各項生物學(xué)指標(biāo)結(jié)果與臨床PV 患者表現(xiàn)的HGB、RBC、HCT 增多、脾臟腫大、髓外造血、骨髓粒、紅與巨核細(xì)胞系增生活躍等生物學(xué)特點相似[9-11]。且蘆可替尼作為JAK2 激酶抑制劑,臨床常用于治療PV 繼發(fā)的骨髓纖維化以及對羥基脲無應(yīng)答或不耐受的PV 患者[12]。在本研究中蘆可替尼能明顯抑制PV模型小鼠血液中RBC、HGB、HCT 的增加,降低脾臟重量與脾指數(shù),抑制骨髓中的紅細(xì)胞系增多,并能顯著抑制脾臟造血紅細(xì)胞以及腰椎、股骨、胸骨紅系、粒系造血細(xì)胞的增多。以上指標(biāo)表明BALB/c 小鼠經(jīng)尾靜脈注射1.0×106~1.6×106個·mL-1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BA/F3-JAK2V617F細(xì)胞后可構(gòu)建PV 模型,能較好地模擬PV 在體內(nèi)的發(fā)展過程,為尋找新的治療方案提供一定基礎(chǔ)。

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