藤黃碳量子點(diǎn)的制備、表征及其抗腫瘤活性研究

黃倩倩，鮑倩倩，吳成圓，胡夢茹，陳云娜，王雷*，陳衛(wèi)東*（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；3.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；4.現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)研究中心，合肥 230012）

碳點(diǎn)，一種新型的零維碳質(zhì)納米材料，粒徑1 ～10 nm，制備方法簡單，具有良好的光致發(fā)光性[1]、低細(xì)胞毒性[2]、高水溶性和生物相容性等特點(diǎn)，被廣泛地運(yùn)用于生物成像[3]、分析傳感[4]、藥物輸送[5]以及癌癥治療等領(lǐng)域。目前針對于碳點(diǎn)合成原料多注重于天然化學(xué)物質(zhì)[6-8]及食源性材料[9-11]，以傳統(tǒng)中藥材[12-14]為原料制備而成的碳量子點(diǎn)研究報(bào)道較少。所謂以中藥為源合成碳點(diǎn)是指將中藥材通過一定的物理或化學(xué)手段加工處理使其成為粒徑小于10 nm 的碳基納米材料，由于不同的中藥材中活性成分存在著差異，其衍生出的碳點(diǎn)藥理活性也各不相同，主要發(fā)揮著止血[15]、抗腫瘤[16]、抗菌[17]、抗病毒[18]等藥理作用。此外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)中藥衍生的碳量子點(diǎn)還可以改善原中藥材的某些固有特性（如溶解度[19]），或保留中藥材本身的藥理活性[20]，或增加新的藥理活性[21]等。因此，拓寬以中藥材為原料合成具有熒光特性的碳量子點(diǎn)，可為中藥納米制劑提供新的研究方向。

中藥藤黃（gamboge）是藤黃科植物藤黃樹（Garcinia hanburyiHook.f.）的樹干切傷后分泌的膠樹脂[22]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)藤黃具有抗腫瘤、抗炎和抗病毒活性，但也具有強(qiáng)烈的刺激性和一定的毒性，其主要毒性成分為藤黃酸和新藤黃酸[23]。使用中為降低其毒性作用，常采用不同的炮制方法，高壓蒸制[24]、豆腐制[25]、清水制[26]等。此炮制過程與碳量子點(diǎn)合成途徑相似，因此聯(lián)想到是否能合成其衍生碳點(diǎn)，在改善原料水溶性差和保留原材料抗腫瘤活性的同時(shí)降低其高毒性問題。故本研究采用一步水熱法，以中藥材藤黃為原材料，通過堿摻雜法，制備了一種中藥衍生型藤黃碳量子點(diǎn)（gamboge carbon quantum dots，GCDs），制備過程如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)GCDs 具有優(yōu)異的光致發(fā)光性特性及熒光穩(wěn)定性，且水溶性好，無需超聲處理即可均勻分散，改善了原料藤黃水溶性差的問題，此外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)GCDs 對癌細(xì)胞具有抑制作用，對正常免疫細(xì)胞毒性較低，表明GCDs 可保留原材料藤黃的藥理作用，發(fā)揮一定的抗腫瘤活性同時(shí)又顯著地降低其高毒性。

圖1 GCDs 的合成示意圖Fig 1 Synthesis schematic diagram of GCDs

1 材料

1.1 儀器

AB135-S 型十萬分之一電子分析天平（德國METTLER TOLEDO 公司）；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KQ-300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；F-4600 熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi 公司）；Nicolet 6700 傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛儀器公司）；FEI Tecnai G2 F20 型透射電子顯微鏡（美國FEI Co 公司）；SPECORD S600 型紫外分光光度計(jì)（德國Analytik Jena 公司）。

1.2 試藥

藤黃藥材（安徽亳州藥材交易市場）；氫氧化鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限責(zé)任公司）；透析袋1000 Da（USA 進(jìn)口透析袋）；硫酸奎寧（上海阿拉丁生化科技股份有限責(zé)任公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；MTT（美國Sigma 公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7、人肝癌細(xì)胞株Bel 7402 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 碳量子點(diǎn)的制備

采用一步水熱法制備碳量子點(diǎn)：藥材藤黃經(jīng)研磨后過80 目篩，得藤黃粉末。稱取0.45 g 藤黃粉末于50 mL 燒杯中，加入30 mL 0.1 mol·L－1的NaOH溶液，超聲攪拌10 min，然后將混合物轉(zhuǎn)移到50 mL 特氟隆高壓釜中，180℃水熱反應(yīng)5 h，待反應(yīng)冷卻至室溫下，溶液由無色變?yōu)楹谧厣?，表明GCDs的形成。將溶液以13 000 r·min－1離心10 min，除去沉淀，上清液采用0.22 μm 有機(jī)膜過濾，然后在超純水中用透析袋透析24 h（透析液每6 h 更換一次），去除雜質(zhì)，最后冷凍干燥得GCDs 固體粉末。

2.2 量子產(chǎn)率計(jì)算

量子產(chǎn)率（quantun yield，QY）是指激發(fā)態(tài)分子因受激發(fā)，發(fā)射熒光躍遷到基態(tài)的分子與所有激發(fā)態(tài)分子的比例，它是衡量GCDs 性能的重要指標(biāo)。QY通常采用參比法進(jìn)行檢測，本實(shí)驗(yàn)選用硫酸奎寧作為熒光對照品（λex＝360 nm，QY＝54%），將其溶于0.1 mol·L－1H2SO4作為參比物質(zhì)，根據(jù)以下公式計(jì)算GCDs 的QY。

QYC和QYS分別表示GCDs 和硫酸奎寧的量子產(chǎn)率；I代表相同激發(fā)波長下的積分熒光強(qiáng)度；ηC和ηS分別表示GCDs 和硫酸奎寧的溶劑折射率；AC和AS分別表示GCDs 和硫酸奎寧在相同激發(fā)波長下的紫外吸光度。

2.3 GCDs 的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

分別取對數(shù)期生長的RAW 264.7 細(xì)胞和Bel 7402細(xì)胞，以1×105/孔的細(xì)胞密度接種于96 孔板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基。加入200 μL 無血清培養(yǎng)基稀釋的300、250、200、150、100 μg·mL－1GCDs 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h 后，在避光條件下每孔加入20 μL MTT 溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后吸凈上層培養(yǎng)液，每孔平行加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），置于搖床上緩慢震蕩10 min 至藍(lán)紫色結(jié)晶溶解，使用酶標(biāo)儀于490 nm 波長處檢測吸光度（OD）值。

3 結(jié)果與討論

3.1 TEM 表征

取適量GCDs 粉末，溶于少量超純水中加以稀釋，并滴加于超薄碳膜上風(fēng)干過夜。待樣品完全干燥后，于透射電子顯微鏡下觀察GCDs 的形貌和尺寸。結(jié)果如圖2所示，GCDs 在水溶液中為球形，分散均勻，平均粒徑為3.33 nm。

圖2 GCDs 的透射電鏡TEM 圖（A）及粒徑分布圖（B）Fig 2 Transmission electron micrograph（TEM）diagram（A）and particle size distribution diagram（B）of GCDs

3.2 FT-IR 分析

圖3所示為藤黃原材料及其衍生碳點(diǎn)GCDs 的FT-IR 譜圖。由圖可見GCDs 與原料藤黃相比在3400 cm－1左右的吸收峰變寬，1450 ～1750 cm－1的吸收峰減少，其中3399 cm－1的寬吸收峰是羧酸上羥基的伸縮振動(dòng)峰[27]，2936 cm－1、1566 cm－1處的吸收峰分別為亞甲基結(jié)構(gòu)的伸縮振動(dòng)和不對稱面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1394 cm－1處的吸收峰為甲基的對稱面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1101 cm－1的弱吸收峰歸因于酚羥基碳氧鍵的伸縮振動(dòng)，綜上表明新的納米材料GCDs 的形成。

圖3 藤黃及其衍生碳量子點(diǎn)的紅外光譜圖Fig 3 FT-IR spectrum of gamboge and GCDs

3.3 XPS 分析

通過XPS 元素對GCDs 的化學(xué)成分和表面含有的化學(xué)鍵進(jìn)行分析[28]，結(jié)果如圖4A 所示，GCDs的主要吸收峰分別對應(yīng)著C 1s、O 1s 等元素，鍵能分別為285.08、532.08 eV，其中C、O 含量比例占據(jù)主導(dǎo)，即藤黃為該碳量子點(diǎn)的主要骨架。隨后對XPS 的主要吸收峰進(jìn)行分峰處理，結(jié)果如圖4B、4C 所示。圖4B 為C 1s 的分峰圖，主要鍵能分別為284.8、286.47、288.12 eV，分別對應(yīng)C ＝C/C-C、C-O/C-OH、O-C＝O 鍵[29]。圖4C 為O 1s 的分峰圖，主要鍵能分別為531.10、532.78、535.62 eV，分別對應(yīng)C ＝O、C-O-C/C-OH、O-C ＝O 鍵[30]。這些結(jié)果與紅外圖譜分析相一致，綜上分析結(jié)果表明，該碳點(diǎn)表面含有羥基等親水性官能團(tuán)，使其在水中易于分散，提高水溶性，改善了藤黃的疏水性能。

圖4 GCDs 的XPS 總譜（A）和高分辨率C 1s（B）和O 1s（C）譜圖Fig 4 XPS survey spectrum（A）and high resolution（B）C 1s and（C）O 1s of GCDs

3.4 熒光光譜及UV-Vis 分析

將GCDs 粉末溶解于超純水中，稀釋至適宜濃度后置于比色皿中，使用紫外和熒光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描檢測，記錄GCDs 的紫外及熒光光譜，結(jié)果見圖5。GCDs 的紫外-可見光吸收光譜，GCDs在297 nm 處有特征吸收峰，對應(yīng)于GCDs 上C ＝C 鍵π-π*躍遷。此外，GCDs 溶液最大激發(fā)波長在367 nm，發(fā)射波長位于455 nm，如圖5A 所示，且在日光下為淺黃色液體，在365 nm 紫外燈照射下發(fā)出藍(lán)色熒光，與CIE 色相圖5B 相一致。

圖5 GCDs 的紫外吸收和熒光光譜圖（A）及CIE 圖（B）Fig 5 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of GCDs（A）and CIE diagram（B）

3.5 熒光穩(wěn)定性分析

3.5.1 濃度穩(wěn)定性 通過對碳量子點(diǎn)溶液濃度考察，選擇合適的濃度用以熒光檢測，結(jié)果如圖6所示，隨著GCDs 的濃度增大，熒光強(qiáng)度先增加后降低，推測濃度過高導(dǎo)致熒光降低可能是由于激發(fā)分子碰撞概率增加及自吸收加強(qiáng)，導(dǎo)致熒光發(fā)生淬滅[31]。當(dāng)碳量子點(diǎn)溶液質(zhì)量濃度在0.5 mg·mL－1時(shí)，熒光強(qiáng)度最大。

圖6 GCDs 濃度穩(wěn)定性Fig 6 Concentration stability of GCDs

3.5.2 激發(fā)波長穩(wěn)定性 利用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長300 ～400 nm 間進(jìn)行檢測，熒光譜圖如圖7。由圖7A 可以看出，隨著激發(fā)波長的增加，熒光強(qiáng)度先增加后降低。由圖7B 可以看出，隨著激發(fā)波長的增加，發(fā)射峰位置發(fā)生明顯紅移，說明該碳量子點(diǎn)具有典型的激發(fā)波長依賴性熒光特性，這可能與GCDs 的不同粒徑分布和不同表面態(tài)有關(guān)。通過參比法可知該碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率為0.4%。

圖7 激發(fā)波長在300 ～400 nm 的GCDs 的熒光光譜圖（A）和歸一化熒光光譜圖（B）Fig 7 Fluorescence spectra of GCDs with excitation wavelength of 300～400 nm（A）and corresponding normalized fluorescence spectra（B）

3.5.3 離子強(qiáng)度穩(wěn)定性 通過配制不同濃度梯度的NaCl 溶液（0.2 ～2 mol·L－1），加入等體積的GCDs 溶液，于最佳激發(fā)波長下測定熒光發(fā)射光譜（F表示加入NaCl 后的溶液熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0表示未加入NaCl 溶液的熒光強(qiáng)度），結(jié)果如圖8所示，隨著NaCl 溶液濃度的增加，碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度沒有受到過大的波動(dòng)，即該量子點(diǎn)不易受到離子強(qiáng)度的影響，在NaCl 溶液中可保持良好的熒光穩(wěn)定性。

圖8 不同氯化鈉濃度下的GCDs 熒光強(qiáng)度（ ±s，n ＝3）Fig 8 Fluorescence intensity of GCDs under different sodium chloride concentrations（ ±s，n ＝3）

3.5.4 pH 穩(wěn)定性 為進(jìn)一步研究GCDs 對于介質(zhì)pH 的敏感性，考察了其在pH 1 ～14 的溶液中熒光強(qiáng)度變化。結(jié)果如圖9可知，隨著pH 的增大，溶液堿性越強(qiáng)，熒光強(qiáng)度越高。這一特性可能是因?yàn)镚CDs 表面基團(tuán)在酸性條件下容易發(fā)生氫鍵締合作用，使GCDs 產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光淬滅，而在堿性條件下，容易發(fā)生解離或電荷轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)去質(zhì)子化現(xiàn)象，使得GCDs 表面帶上負(fù)電荷，分子之間產(chǎn)生靜電排斥作用呈現(xiàn)單分散，熒光強(qiáng)度增加。基于此pH 敏感性效應(yīng)，可用于腫瘤檢測方面，因?yàn)橥ǔＧ闆r下腫瘤細(xì)胞內(nèi)的pH 呈現(xiàn)酸性，而正常細(xì)胞為中性，利用GCDs 在酸性條件下熒光強(qiáng)度減弱的特性，來檢測腫瘤細(xì)胞的位置和狀態(tài)。

圖9 不同pH 條件下的GCDs 熒光強(qiáng)度Fig 9 Fluorescence intensity of GCDs under different pH conditions

3.5.5 不同金屬陽離子對碳量子點(diǎn)熒光穩(wěn)定性的影響 取等體積的碳量子點(diǎn)溶液，分別加入濃度均 為50 μmol·L－1的K＋、Na＋、Mg2＋、Ba2＋、Ca2＋、Zn2＋、Mn2＋常見金屬離子，在最佳激發(fā)波長下測定其發(fā)射光譜，以未加金屬離子的作為對照組，然后以熒光強(qiáng)度（F/F0）對不同金屬離子作圖（F表示加入金屬離子后的溶液熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0表示未加入金屬離子的溶液熒光強(qiáng)度），通過對碳量子點(diǎn)在各種常見金屬離子中的穩(wěn)定性進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)（見圖10），當(dāng)加入這些金屬陽離子后，熒光強(qiáng)度大都保持在0.9 以上，即可以穩(wěn)定存在于各種金屬離子中，不會(huì)對其熒光強(qiáng)度產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象，具有良好的穩(wěn)定性和抗外界干擾能力。

圖10 GCDs 在常見金屬離子中的穩(wěn)定性（ ±s，n ＝3）Fig 10 Stability of GCDs in common metal ions（ ±s，n ＝3）

3.5.6 氙燈照射時(shí)間穩(wěn)定性 為了研究GCDs 對外界環(huán)境的抗干擾能力，配制一定濃度的GCDs溶液，置于氙燈下照射30 min，觀察GCDs 熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果如圖11 所示，可明顯看到GCDs的熒光強(qiáng)度趨于平衡，波動(dòng)較小，說明該方法制備的GCDs 具有良好的抗光干擾性能。

圖11 GCDs 在氙燈照射下的熒光穩(wěn)定性Fig 11 Fluorescence stability of GCDs under xenon lamp irradiation

3.6 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

通過MTT 細(xì)胞毒性研究觀察GCDs 對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 和人肝癌細(xì)胞Bel 7402 的作用，結(jié)果如圖12 所示，GCDs 在100 ～300 μg mL－1時(shí)對小鼠正常免疫細(xì)胞呈現(xiàn)較低的細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率在75%以上，而對于腫瘤細(xì)胞而言，GCDs 在低濃度100 μg·mL－1時(shí)無明顯的細(xì)胞毒性，在150 ～300 μg·mL－1時(shí)隨著劑量增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，具有一定的細(xì)胞毒性，當(dāng)濃度高于200 μg·mL－1時(shí)細(xì)胞存活率降低至50%以下，其IC50為199.1 μg·mL－1，綜上結(jié)果表明GCDs 對正常細(xì)胞毒性較低，而對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制增殖作用，即可保留原料藤黃抗腫瘤活性的同時(shí)降低其高毒性，推測這一現(xiàn)象可能是由于原材料在水熱反應(yīng)過程中發(fā)生重構(gòu)，形成新成分碳量子點(diǎn)，而該碳量子點(diǎn)表面的活性官能團(tuán)是其發(fā)生選擇性細(xì)胞毒性的主要原因[32]。

圖12 GCDs 對RAW 264.7、Bel 7402細(xì)胞存活率的影響（ ±s，n＝3）Fig 12 Effect of GCDs on the cell viability of RAW 264.7 and Bel 7402 cells（ ±s，n ＝3）

4 結(jié)論

本研究從藤黃炮制角度出發(fā)，考慮到炮制過程與碳量子點(diǎn)合成途徑相似，利用堿摻雜法，首次以藤黃為原料，通過一步水熱反應(yīng)合成具有熒光特性的藤黃衍生碳量子點(diǎn)，通過TEM、FT-IR、熒光分光光度計(jì)及XPS 等對其進(jìn)行了一系列表征發(fā)現(xiàn)GCDs 具有極好的水溶性和優(yōu)異的光致發(fā)光性。通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GCDs 對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制效率，呈現(xiàn)抗腫瘤作用而對正常免疫細(xì)胞僅表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性，表明該GCDs 可大大降低原料藤黃的高毒性，改善藥理活性，這為后期進(jìn)一步研究其抗腫瘤活性機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。