布地奈德脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)選及質(zhì)量評價(jià)

馬瑞麗，楊東亮，趙宇郁，周婧，馬桂芝*（.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，烏魯木齊 8300；.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是結(jié)腸的一種慢性免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病。在全球范圍內(nèi)，UC 的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。糖皮質(zhì)激素是活動期UC 患者誘導(dǎo)治療的重要藥物[2-3]，對5-氨基水楊酸應(yīng)答不佳的輕、中度UC，常需全身給予糖皮質(zhì)激素治療，但全身激素用藥易導(dǎo)致諸多藥物不良反應(yīng)，如感染、庫欣綜合征、骨質(zhì)疏松癥等[4]。布地奈德（budesonide）是一種合成的第二代皮質(zhì)類固醇類激素，在局部給藥部位具有很強(qiáng)的抗炎作用，較其他皮質(zhì)類固醇全身毒性小、不良反應(yīng)少[5-7]，可抑制細(xì)胞免疫，減少炎性細(xì)胞浸潤，穩(wěn)定溶酶體膜，減低毛細(xì)血管通透性[8]，可有效誘導(dǎo)部分輕中度UC 患者的癥狀緩解[9]。

目前，臨床上多采用吸入用布地奈德混懸劑灌腸[10]，然而普通混懸液幾乎沒有生物黏附性，在直腸的自身蠕動作用下，在腸道保留時(shí)間短，局部吸收差，且布地奈德幾乎不溶于水，限制了藥物的局部吸收效果，影響藥物療效。脂質(zhì)體特殊的磷脂雙分子層的膜結(jié)構(gòu)可提高疏水性藥物的分散度，增加藥物溶解度，從而有可能增加布地奈德在直腸的局部吸收和局部藥物濃度[11]，并且有報(bào)道稱脂質(zhì)體直接局部給藥能提高局部治療效果，降低全身給藥的不良反應(yīng)[12]。故本研究優(yōu)選布地奈德脂質(zhì)體的制備工藝，為后期該藥直腸定向給藥系統(tǒng)的研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；New Classic MS 分析天平（梅特勒-托利多公司，d ＝0.01 mg）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測定儀（英國馬爾文儀器有限公司）；PS-1000 磁力攪拌器（東京理化器械株式會社）；3-18KS 臺式高速冷凍離心機(jī)（SIGMA 公司）；VCX500 超聲波細(xì)胞破碎儀（Sonics&Materials Inc）；Milli-Q 艾柯超純水儀（美國密理博公司）；JEM-1230 透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 試藥

布地奈德對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y13J7C9082，純度≥98%）；布地奈德原料藥（山東泰華生物科技有限公司，批號：20190906，純度≥99%）；大豆磷脂（批號：SYSO-200401）、膽固醇（批號：B80859）（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體中布地奈德含量的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-水（72∶28）為流動相等度洗脫，檢測波長260 nm，流速1 mL·min－1，柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取布地奈德對照品適量，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成196.4 μg·mL－1的對照品儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取布地奈德脂質(zhì)體1.0 mL 于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分震蕩，搖勻，于4℃、15 000 r·min－1離心15 min，取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液適量，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 制備不含布地奈德的空白脂質(zhì)體，同“2.1.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.5 專屬性考察 取布地奈德對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液和空白溶劑甲醇各10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。在陰性樣品溶液的色譜圖中對照品出峰位置無色譜峰，提示基質(zhì)對布地奈德的測定無干擾。理論板數(shù)按布地奈德計(jì)大于8000。

圖1 布地奈德脂質(zhì)體的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of budesonide liposomes

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密移取對照品儲備液適量，依次稀釋，制成0.38、0.77、1.53、3.07、6.14、12.28、24.55、49.1、98.2 μg·mL－1的系列對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，布地奈德的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝1.59×104x＋1.993×103（r＝0.9999）。結(jié)果表明，布地奈德在0.38 ～98.2 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取同一批布地奈德脂質(zhì)體，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.66%，說明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批布地奈德脂質(zhì)體，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在常溫下分別于0、2、4、6、8、12 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為0.82%，表明樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批布地奈德脂質(zhì)體，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品濃度。結(jié)果樣品的平均質(zhì)量濃度為189.8 μg·mL－1，RSD為1.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收試驗(yàn) 精密量取同一批已知質(zhì)量濃度的布地奈德脂質(zhì)體1.0 mL，共9 份，分別置于10 mL 量瓶中，加入不同體積的“2.1.2”項(xiàng)下的對照品儲備液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成低、中、高3 種質(zhì)量濃度的供試品溶液各3 份，并按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的平均加樣回收率在97.7%～100.2%，RSD均＜2%，表明本法準(zhǔn)確度良好。

2.1.11 耐用性試驗(yàn) 取同一批布地奈德脂質(zhì)體，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，參照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，考察不同色譜柱（Agilent SB-C18，SN：USCL074978、Agilent SB-C18，SN：USCL082052、Kromasil C18）、不同流速（0.9、1.0、1.1 mL·min－1）、不同柱溫（20、25、30℃）對測定結(jié)果的影響，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果不同色譜柱的峰面積RSD為3.1%，不同流速的峰面積RSD為2.7%，不同柱溫的峰面積RSD為0.74%，表明該方法耐用性良好。

2.2 脂質(zhì)體工藝優(yōu)選指標(biāo)——綜合評分的計(jì)算

2.2.1 權(quán)重系數(shù)的設(shè)定與綜合評分的計(jì)算 采用層次分析法[13]進(jìn)行綜合評分，以包封率、載藥量和粒徑作為考察指標(biāo)，引入九分位的相對重要性比例標(biāo)度，評估主體確定各指標(biāo)的相對重要性，賦予各指標(biāo)不同的分?jǐn)?shù)，比較同一層次目標(biāo)的相對重要性，并構(gòu)成兩兩比較矩陣，見表1。得到包封率、載藥量和粒徑的歸一化權(quán)重系數(shù)分別為0.7306、0.1884、0.0810。對其進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，結(jié)果CR＝CI/RI＝0.0567 ＜0.1，表明權(quán)重系數(shù)合理。

表1 指標(biāo)成對比較的判斷優(yōu)先矩陣Tab 1 Judgment priority matrix for pairwise comparison of indicators

結(jié)合層次分析法確定的權(quán)重系數(shù)，得到綜合評分Y＝包封率/包封率最大值×0.7306 ＋載藥量/載藥量最大值×0.1884 ＋粒徑最小值/粒徑×0.0810。

2.2.2 包封率和載藥量的測定[14-15]采用低溫超速離心法測定布地奈德脂質(zhì)體的包封率和載藥量。精密量取布地奈德脂質(zhì)體500 μL 于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇（接近刻度）超聲15 min，破乳后用甲醇定容，混勻后過0.22 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液20 μL 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算布地奈德總量（C總）；取布地奈德脂質(zhì)體適量于離心管中，低溫（4℃）高速（18 000 r·min－1）離心60 min，取上清液500 μL 定容于10 mL 量瓶中，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液20 μL按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算游離的布地奈德（C游），按以下公式計(jì)算包封率和載藥量：包封率＝（C總－C游）/C總×100%，載藥量＝（W總－W游）/稱樣量×100%。

2.2.3 粒徑的測定 取布地奈德脂質(zhì)體乳液，用超純水稀釋10 倍后取適量于測定樣品池中，通過馬爾文納米激光粒徑測定儀對脂質(zhì)體的粒徑進(jìn)行測定，每個(gè)樣品平行測定3 次。

2.3 乙醚注入法的工藝優(yōu)選

2.3.1 制備流程 精密稱取布地奈德原料藥、膽固醇、大豆磷脂適量于西林瓶中，加入5 mL 乙醚超聲使其溶解。將乙醚溶液用注射器緩慢勻速注入到恒溫的20 mL 超純水中，邊注入邊磁力攪拌，另取2 mL 乙醚潤洗西林瓶和注射器，同法注入到超純水中，恒溫?cái)嚢? h，使乙醚揮發(fā)盡后，超聲分散，即得。

2.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲分散時(shí)間、水合介質(zhì)種類和攪拌速度對指標(biāo)的影響較小，故確定以上三因素為固定因素，即超聲分散15 min，水合介質(zhì)為超純水，攪拌速度為500 r·min－1。而膜材比（A）、脂藥比（B）和水合介質(zhì)溫度（C）對指標(biāo)影響較大，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化該三因素組合，優(yōu)選乙醚注入法制備布地奈德脂質(zhì)體的工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的因素水平表Tab 2 Factor and level of central composite design-response surface method

2.3.3 數(shù)據(jù)處理 采用Design-Expert 10.0.7 軟件對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到綜合評分Y的回歸方程為Y＝0.8239－0.0184A－0.034B＋0.0112C＋0.0163AB＋0.0388AC－0.0315BC＋6.6697A2＋0.0178B2－3.3872C2。方差分析見表4。固定其中一個(gè)因素，繪制其他兩個(gè)因素對綜合評分的三維曲面圖，結(jié)果見圖2。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法的結(jié)果Tab 3 Central composite design-response surface method

由表4可知，模型極顯著（P＜0.0001），模型的R2＝0.9680，調(diào)整R2＝0.9393，說明此模型可以解釋96.8%響應(yīng)值的變化，表明模型能較好地反映膜材比（A）、脂藥比（B）和水合介質(zhì)溫度（C）與綜合評分（Y）之間的變化關(guān)系。失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，可認(rèn)為無失擬因素存在。3 個(gè)因素中，A、B和C都為極顯著項(xiàng)（P＜0.01）；兩兩交互項(xiàng)中，AC、BC和BC之間交互作用極顯著（P＜0.01）。

表4 方差分析Tab 4 Analysis of variance

應(yīng)用Design-Expert 10.0.7 軟件對優(yōu)選的制備工藝條件（即A＝12，B＝6，C＝60）進(jìn)行預(yù)測，綜合評分的預(yù)測值為0.926。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 結(jié)合實(shí)際操作條件，初步確定優(yōu)選工藝參數(shù)為：膜材比12∶1，脂藥比6∶1，水合介質(zhì)溫度60℃。按照優(yōu)選參數(shù)，采用乙醚注入法制備3 批布地奈德脂質(zhì)體。結(jié)果3 批布地奈德脂質(zhì)體平均包封率為75.63%，載藥量為9.17%，粒徑為276 nm，包封率、載藥量和粒徑的綜合評分與預(yù)測值相比相對誤差均小于3%，說明工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，結(jié)果見表5。

圖2 布地奈德脂質(zhì)體制備工藝優(yōu)化的效應(yīng)面圖Fig 2 Response surface for optimization of preparation process of budesonide liposomes

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n ＝3)Tab 5 Verification test (n ＝3)

2.4 薄膜分散法的工藝優(yōu)選

2.4.1 工藝流程 精密稱取布地奈德原料藥、膽固醇、大豆磷脂適量于250 mL 的圓底燒瓶中，加入10 mL 氯仿超聲使其溶解。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在真空恒溫水浴條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，使得脂質(zhì)材料在圓底燒瓶內(nèi)壁形成一層透明狀的均勻薄膜，增大真空度除去殘留有機(jī)溶劑。加入超純水20 mL，搖晃至均勻混合，恒溫水浴下常壓旋轉(zhuǎn)水合30 min，冰浴條件下探頭超聲（超2 s，停3 s），即得。

2.4.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在預(yù)試驗(yàn)中采用單因素試驗(yàn)考察了膜材比、脂藥比、有機(jī)溶劑種類、水合介質(zhì)種類、旋蒸溫度、超聲功率和超聲時(shí)間7 個(gè)因素對指標(biāo)的影響，結(jié)果表明膜材比、有機(jī)溶劑種類、水合介質(zhì)種類、旋蒸溫度和超聲功率對指標(biāo)的影響較小，可作為固定因素，其因素水平固定為膜材比12∶1、有機(jī)溶劑為氯仿、水合介質(zhì)為超純水、旋蒸溫度為20℃，超聲功率為30%。脂藥比（A）和超聲時(shí)間（B）對指標(biāo)影響較大，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選薄膜分散法的最佳制備工藝。結(jié)果薄膜分散法最佳工藝制備的脂質(zhì)體平均包封率為67.09%，平均載藥量為7.56%，平均粒徑為279.87 nm。

2.5 制備方法的確定

通過對乙醚注入法和薄膜分散法的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙醚注入法制備的布地奈德脂質(zhì)體的包封率、載藥量和綜合評分都相對較高，故最終確定乙醚注入法為布地奈德脂質(zhì)體的制備方法。

2.6 最優(yōu)處方布地奈德脂質(zhì)體的質(zhì)量評價(jià)

2.6.1 形態(tài)觀察 在室溫條件下，取適量最優(yōu)處方制備的布地奈德脂質(zhì)體原液，滴于銅網(wǎng)上靜置5 min 后，用濾紙吸掉多余混懸液，用2%磷鎢酸負(fù)染30 s 后晾干，置于透射電鏡下觀察并拍照，如圖3所示。透射電鏡結(jié)果顯示，脂質(zhì)體粒子小而均勻，呈球形，且粒子大小與粒徑測定結(jié)果基本吻合。

圖3 不同倍數(shù)及標(biāo)尺下布地奈德脂質(zhì)體的透射電鏡圖Fig 3 Transmission electron micrograph of budesonide liposomes at different multiples and scales

2.6.2 包封率和載藥量的測定 按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定布地奈德脂質(zhì)體的包封率和載藥量，結(jié)果其包封率為（75.63±1.1）%，載藥量為（9.17±0.4）%。

2.6.3 粒徑、分散指數(shù)和電位的測定 按“2.2.3”項(xiàng)下方法測得布地奈德脂質(zhì)體的平均粒徑為（276±32.9）nm，PDI 為（0.35±0.1），平均Zeta電位為－（44.87±5）mV。布地奈德脂質(zhì)體的粒徑和Zeta 電位分布見圖4。

圖4 布地奈德脂質(zhì)體的粒徑（A）和Zeta 電位分布（B）Fig 4 Particle size（A）and Zeta potential distribution（B）of budesonide liposomes

3 討論

布地奈德一般采用高效液相法進(jìn)行含量測定[16]，本文采用二極管陣列檢測器對對照品溶液進(jìn)行全波長掃描發(fā)現(xiàn)，布地奈德在244 nm 波長處有最大吸收，但在該波長處，溶劑甲醇會對樣品的測定產(chǎn)生干擾。通過改變色譜條件、流動相比例、柱溫等依然無法排除溶劑的干擾，故最終選擇溶劑在布地奈德出峰的位置沒有干擾的260 nm 作為含量測定的檢測波長。

在預(yù)試驗(yàn)中曾以包封率、載藥量、粒徑、PDI和電位5 個(gè)指標(biāo)作為評價(jià)制備工藝的參數(shù)，但單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，各考察因素的水平值的改變對PDI 和電位并無顯著影響，故最終只選擇包封率、載藥量和粒徑3 個(gè)指標(biāo)。為保證評價(jià)結(jié)果的科學(xué)性和合理性，本試驗(yàn)采用層次分析法對多指標(biāo)進(jìn)行賦權(quán)，以加權(quán)后綜合評分為因變量，不僅能全面地反映各檢測指標(biāo)對脂質(zhì)體的重要程度，也能直觀地反映整體制備工藝。

薄膜分散法和溶劑注入法是制備脂質(zhì)體時(shí)較常用的兩種方法。本試驗(yàn)采用薄膜分散法制備布地奈德脂質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體粒徑太大。通過物理方法探頭超聲或者過膜之后，粒徑都有所減小，但脂質(zhì)體的包封率會明顯降低，這可能與薄膜分散法制備的脂質(zhì)體粒徑本身比較大有關(guān)（有文獻(xiàn)報(bào)道薄膜分散法制備的脂質(zhì)體粒徑一般在1 ～5 μm[17]），而物理方法處理時(shí)對脂質(zhì)體膜壁會造成一定的破壞，導(dǎo)致包封率顯著降低。而乙醚注入法制備的脂質(zhì)體本身粒徑就比較小，一般在50 ～200 nm[17]，無需再通過物理方法來減小粒徑，因此包封率較高。

綜上所述，本文建立的測定布地奈德脂質(zhì)體含量的高效液相檢測方法準(zhǔn)確可靠、專屬性強(qiáng)，優(yōu)選的制備工藝簡單穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可用于布地奈德脂質(zhì)體的制備。