尿石素A改善線粒體氧化應(yīng)激抗血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老

康秉文，陳蓉，殷草草，石瑩，王玥，劉啟玲，秦緒軍*（.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西咸陽 7046；.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西安 70069）

血管自身的衰老是導(dǎo)致心血管疾病高死亡率的重要危險(xiǎn)因素之一，它影響了心血管疾病的發(fā)病過程以及嚴(yán)重程度[1-2]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，與血液的成分直接接觸。隨著年齡的增長，血管內(nèi)皮細(xì)胞易受血流中異常成分等因素的影響，誘發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老。表現(xiàn)為細(xì)胞增殖減少，G0/G1期停滯，細(xì)胞遷移受阻以及內(nèi)皮功能障礙等。越來越多的研究結(jié)果表明內(nèi)皮細(xì)胞衰老是血管衰老發(fā)展過程的關(guān)鍵步驟[3-4]。因此揭示內(nèi)皮細(xì)胞衰老機(jī)制可以為預(yù)防和治療心血管疾病提供依據(jù)。

環(huán)境因素能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞的衰老，但具體機(jī)制仍然不清楚[5-6]。氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生大量活性氧（ROS）在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞衰老以及血管衰老的過程中具有重要作用[7]。ROS 能夠誘導(dǎo)DNA 損傷、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、細(xì)胞衰老以及凋亡[8]。雖然低劑量ROS 對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)是有益的，但是，過度的ROS 產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡[9]。線粒體是細(xì)胞ROS 產(chǎn)生的主要來源，細(xì)胞內(nèi)90%以上的ROS 來源于線粒體的氧化磷酸化。線粒體通過產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）以及其他代謝產(chǎn)物在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、免疫反應(yīng)以及基因表達(dá)中都發(fā)揮了重要作用[10-11]。因此，線粒體功能對于維持細(xì)胞正常功能以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)都至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能損傷引起的線粒體ROS（mtROS）產(chǎn)生增加或抗氧化防御體系的降低可以促進(jìn)細(xì)胞衰老，比如敲除線粒體抗氧化酶SOD2 會(huì)使mtROS 增加并伴有血管功能的損傷，而mtROS 的增加也會(huì)使氧化應(yīng)激增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞衰老[12-13]。

尿石素A（UA）是于石榴、草莓以及其他的堅(jiān)果中主要成分——鞣花單寧和鞣花酸的一種代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，UA 通過誘導(dǎo)線粒體自噬延長線蟲壽命[14]，通過緩解氧化應(yīng)激抑制巨噬細(xì)胞中炎癥因子的產(chǎn)生[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，UA 能夠緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠大腦的衰老[15]。這些研究提示，UA 具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)自噬以及抗衰老等作用。為進(jìn)一步明確UA 的抗衰老作用，并且探討其中的內(nèi)在機(jī)制，本研究觀察了UA 對血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老的影響及其抗氧化機(jī)制。

1 材料

HUVEC 細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫）；UA（上海陶素生化科技有限公司，純度≥98%）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）；蛋白定量分析試劑盒（Thermo）；DCFH-DA 熒光探針（Sigma）；過氧化氫酶（CAT）活性試劑盒、總SOD 活性試劑盒、SA-β-gal 染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；CCK-8 試劑盒（漢恒生物）；丙二醛（MDA）試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；Actin、SOD2 鼠抗單克隆抗體（Santa Cruz）；總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；β-gal活性試劑盒、MitoSOX 熒光染料、二氧化碳孵育箱（Thermo）；細(xì)胞凋亡線粒體膜電位（JC-1）檢測試劑盒（江蘇凱基）；CKX41 倒置顯微鏡（日本Olympus）；Infinite200 PRO 全波長多功能酶標(biāo)儀（Tecan）；流式細(xì)胞儀（BD）；Trans Blot Turbo 蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；BX43 熒光顯微鏡（Olympus）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

HUVEC 細(xì)胞在37 ℃，5% CO2條件下，采用DMEM 高糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為4 組：對照（Control）組，模型（Model）組，低劑量UA 處理組（10 μmol·L－1），高劑量UA處理組（20 μmol·L－1）。其中模型組、UA 低、高劑量組加入D-半乳糖質(zhì)量濃度為10 g·L－1，共處理3 d。每組設(shè)立3 個(gè)平行樣。

2.2 β-gal 染色及活性檢測

吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗一次后加入1 mL固定液，室溫固定15 min。用1×PBS 洗3 次，3 min/次。滴加染色工作液，37℃過夜。光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。消化、離心收集細(xì)胞于離心管內(nèi)。加入100 μL 裂解緩沖液裂解，劇烈震蕩15 s，間隔10 min，共40 min。12 000 g、4℃離心20 min，取10 μL 使用BCA 法，測定蛋白濃度；取80 μL上清液中加入等量的β-半乳糖苷酶試劑于405 nm波長測定吸光度。

2.3 細(xì)胞MDA、SOD 以及CAT 活性檢測

采用對應(yīng)試劑盒分別測定MDA、總SOD 及CAT 活性。在樣品充分裂解后，分別按照說明進(jìn)行操作，并使用BCA 法檢測樣品蛋白濃度。

2.4 細(xì)胞總ROS 和線粒體ROS 檢測

采用熒光探針（DCFH-DA）標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞總ROS。在細(xì)胞中加入濃度為10 μmol·L－1的DCFH-DA，37℃避光孵育30 min，孵育完成后用1×PBS 重懸清洗3 次，重懸后用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)L-1 通道測定平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

采用MitoSOX 標(biāo)記，熒光顯微鏡觀察線粒體ROS。在細(xì)胞中加入濃度為5 μmol·L－1的MitoSOX，37℃避光孵育10 min，孵育完成后，用1×PBS 清洗3 次，Hoechst 復(fù)染，熒光顯微鏡觀察。

2.5 JC-1 染色和JC-1 膜電位檢測

采用JC-1 染色和JC-1 膜電位檢測線粒體膜電位。將12 孔板中的細(xì)胞用1×PBS 清洗一次，加入事先配制好的JC-1 工作液（8 μL JC-1 加入3600 μL 滅菌去離子水，充分溶解后加入400 μL 10×Incubation Buffer），充分覆蓋。37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育17 min。用1×Incubation Buffer洗2 次，加入 1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察。對6 孔板細(xì)胞用1×PBS 清洗一遍，然后消化、離心收取細(xì)胞于1.5 mL EP 管中。用PBS 洗2 遍（2000 g，5 min），加入1 mL JC-1 工作液均勻懸浮細(xì)胞，37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育20 min。用1×Incubation Buffer 洗2 次，離心收集細(xì)胞。最后加入200 μL 1×Incubation Buffer 重懸后用流式細(xì)胞儀檢測。

2.6 RT-PCR 技術(shù)檢測

將RNA 提取試劑盒提取的總RNA 用Iscript cDNA 合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄cRNA。定量RT-PCR分析根據(jù)Power SYBR 試劑盒說明進(jìn)行操作，以β-actin 為內(nèi)參，用2－△△CT法計(jì)算p21 mRNA 的相對表達(dá)水平，采用Bio-Rad 公司的CFX Connect實(shí)時(shí)系統(tǒng)進(jìn)行檢測。

2.7 Western Blot 檢測

用裂解緩沖液裂解各組細(xì)胞。使用BCA 法測定蛋白濃度。將等量的蛋白（20 μg）加到配制好的凝膠中，恒壓150 V 電泳60 min。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，迅速將轉(zhuǎn)好的膜放入1×TBST 漂洗一遍。一抗在4 ℃孵育過夜，用TBST 清洗PVDF膜3 次。二抗在25℃孵育2 h，用TBST 清洗PVDF 膜4 次。發(fā)光液A 與發(fā)光液B 按1∶1 混勻，覆于PVDF 膜表面，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。最后采用Bio-Rad Quantity One 軟件對條帶進(jìn)行定量分析。

2.8 線粒體耗氧率分析

采用Serhorse XF24 分析儀（Seahorse Bioscience，USA）細(xì)胞線粒體壓力檢測試劑盒檢測細(xì)胞呼吸率。按照10 000 個(gè)細(xì)胞每孔將D-半乳糖和不同濃度UA 處理后的細(xì)胞接種在24 孔的XF 分析儀細(xì)胞培養(yǎng)板中，處理3 d 后，采用含5 mmol·L－1葡萄糖和1 mmol·L－1丙酮酸鈉的XF 實(shí)驗(yàn)緩沖液洗滌細(xì)胞，37℃無CO2條件下孵育1 h。在給予復(fù)合物V 抑制劑oligomycin（1 μmol·L－1）、FCCP、復(fù)合物Ⅰ抑制劑魚藤酮（1 μmol·L－1）和復(fù)合物Ⅲ抑制劑antimycin A（1μmol·L－1）混合物條件下檢測細(xì)胞耗氧量（oxygen consumption rate，OCR），采用Serhorse XF24 分析儀檢測后，Seahorse Wave 軟件分析數(shù)據(jù)，細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化所有數(shù)據(jù)。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以±s形式表示。多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），運(yùn)用Dunnett’st檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 UA 改善D-半乳糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老

采用不同劑量的UA 處理細(xì)胞2 d，采用CCK-8 試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5、1、5、10、20 μmol·L－1的UA處理均不影響HUVEC 細(xì)胞增殖，而50 μmol·L－1的UA處理顯著抑制了細(xì)胞增殖（P＜0.05），見圖1A。因此，筆者選擇10 μmol·L－1和20 μmol·L－1的UA 用于后面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。10 g·L－1D-半乳糖處理能夠誘導(dǎo)β-gal 染色增加、活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見圖1B；誘導(dǎo)細(xì)胞增殖抑制因子p21 水平顯著增加（P＜0.05），見圖1D。而UA處理能夠顯著拮抗這些衰老指標(biāo)的改變。表明D-半乳糖誘導(dǎo)了HUVEC 細(xì)胞衰老，而UA 處理能夠有效逆轉(zhuǎn)這些改變，緩解細(xì)胞衰老。

圖1 不同劑量UA 對HUVEC 細(xì)胞衰老的影響Fig 1 Effect of different doses of UA on the HUVEC senescence

3.2 UA 改善D-半乳糖誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞氧化應(yīng)激

細(xì)胞氧化應(yīng)激是ROS 產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)失衡引起的應(yīng)激狀態(tài)。MDA 是ROS 在體內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，代表了氧化損傷水平。而SOD 以及CAT 是體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分。本研究中，D-半乳糖處理顯著增加了HUVEC 細(xì)胞中MDA 水平（P＜0.05），降低了SOD 和CAT 活性（P＜0.05），見 圖2A ～2C。DCFH-DA 染色后流式細(xì)胞檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著增加（P＜0.05），見圖2D。而UA 處理后顯著抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，降低了MDA 含量，提高了SOD 和CAT 活性。結(jié)果表明，UA 能顯著改善D-半乳糖導(dǎo)致的細(xì)胞氧化應(yīng)激。

圖2 不同劑量UA 對HUVEC 細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig 2 Effect of different doses of UA on the HUVEC oxidative stress

3.3 UA 改善D-半乳糖誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激水平

線粒體作為細(xì)胞ROS 產(chǎn)生的主要場所導(dǎo)致其成為ROS 損傷的重要靶點(diǎn)。線粒體氧化應(yīng)激直接影響線粒體功能。SOD2 是存在于線粒體內(nèi)的主要抗氧化酶。研究發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖處理顯著降低了SOD2 表達(dá)水平（P＜0.05），見圖3A、3B；線粒體MitoSOX 染色結(jié)果表明mtROS 水平顯著增加（P＜0.05），見圖3C。UA 能夠促進(jìn)SOD2 的表達(dá)，有效抑制由于D-半乳糖導(dǎo)致的mtROS 增加；表明UA 能夠有效改善線粒體氧化應(yīng)激水平。

3.4 UA 改善D-半乳糖誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞線粒體氧化呼吸功能異常

線粒體氧化磷酸化是細(xì)胞內(nèi)ATP 產(chǎn)生的主要途徑，而其副產(chǎn)物是mtROS。在線粒體功能正常狀態(tài)下，mtROS 的產(chǎn)生維持在低水平，僅僅作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子。但是當(dāng)其功能受損時(shí)，ATP 的產(chǎn)生顯著下降，而mtROS 的產(chǎn)生顯著增加，線粒體氧化應(yīng)激水平增加，這些將會(huì)進(jìn)一步加重線粒體功能受損，形成惡性循環(huán)。正常線粒體的膜電位較高，JC-1 聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；線粒體受損時(shí)，膜電位下降，JC-1 以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光。研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖處理顯著降低了線粒體膜電位，見圖4A、4B；抑制了細(xì)胞的線粒體氧化呼吸功能，見圖4C。而UA 處理能夠提高線粒體膜電位，改善線粒體氧化呼吸功能（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，UA 處理可能通過改善線粒體膜電位和線粒體呼吸功能，從而改善線粒體氧化應(yīng)激狀態(tài)，這可能是其抗細(xì)胞衰老的重要機(jī)制。

4 討論

細(xì)胞衰老的重要理論之一是線粒體自由基理論。衰老過程中，線粒體中ROS 水平增加會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA 及分子的結(jié)構(gòu)和功能的異常，這會(huì)引起線粒體氧化磷酸化水平的降低，從而進(jìn)一步增加ROS 的產(chǎn)生。這種惡性循環(huán)導(dǎo)致了細(xì)胞ATP 產(chǎn)生能力下降、細(xì)胞增殖停滯、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞衰老等[16]。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)衰老過程中mtROS 水平增加，線粒體DNA 突變增加，線粒體功能下降[17-18]。因此改善線粒體氧化應(yīng)激成為抗衰老的重要策略之一。

炎癥、腫瘤、缺血再灌損傷以及自噬病理生理過程與ROS 都有著密切關(guān)系，ROS 能夠通過調(diào)控眾多轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 和STAT3 等及生長因子、細(xì)胞因子等調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號(hào)通路[19]。因此，ROS是調(diào)節(jié)氧化還原信號(hào)相關(guān)通路及病理生理過程的重要因子。因此，通過減少ROS，改善氧化應(yīng)激成為UA 緩解或預(yù)防臨床疾病的潛在共有機(jī)制。

圖3 不同劑量UA 對HUVEC 細(xì)胞抗氧化酶SOD2 表達(dá)和線粒體氧化應(yīng)激的影響Fig 3 Effect of different doses of UA on the mitochondrial oxidative stress and the SOD2 expression of HUVEC

圖4 不同劑量UA 對HUVEC 細(xì)胞線粒體功能的影響Fig 4 Effect of different doses of UA on the HUVEC mitochondrial function

D-半乳糖誘導(dǎo)衰老是被廣泛采用的人工誘導(dǎo)衰老模型方法之一。對于D-半乳糖誘導(dǎo)衰老機(jī)制報(bào)道也很多，比如谷氨酰胺合成酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、干擾線粒體功能和誘發(fā)氧化損傷，其中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激一直被認(rèn)為是重要的機(jī)制，這也符合自由基的衰老理論。本研究發(fā)現(xiàn)，在D-半乳糖誘導(dǎo)的HUVEC 細(xì)胞衰老過程中，細(xì)胞ROS 水平增加，細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)降低，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增加，細(xì)胞衰老程度加劇。而UA 處理則能減少ROS 與MDA 水平，提高抗氧化酶SOD2 和CAT 的表達(dá)及活性，從而改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激，緩解細(xì)胞衰老。這表明UA 可能通過改善氧化應(yīng)激來緩解衰老。針對ROS 的主要來源，我們研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)UA 能夠改善線粒體本身的氧化應(yīng)激水平，這應(yīng)該是其降低mtROS 產(chǎn)生以及促進(jìn)線粒體抗氧化系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。而mtROS 是線粒體氧化磷酸化的副產(chǎn)物，這進(jìn)一步表明UA通過改善線粒體氧化磷酸化功能，減少了mtROS的產(chǎn)生，延緩了細(xì)胞衰老。Chen 等[20]發(fā)現(xiàn)UA可以通過miR-34a 調(diào)控SIRT1/mTOR 信號(hào)減輕D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠腦衰老。Gong 等[21]發(fā)現(xiàn)UA 可以通過激活A(yù)MPK 信號(hào)通路改善AD 小鼠腦組織病變。Kujawska 等[22]在帕金森病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)UA 可以通過提高線粒體醛脫氫酶活性和抗凋亡蛋白Bcl-xL 表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)神經(jīng)元存活率。而本研究結(jié)果從線粒體代謝和氧化應(yīng)激角度提供了一個(gè)UA 抗衰老的潛在機(jī)制。

綜上所述，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的主要細(xì)胞器，線粒體代謝和功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞整體功能異常，甚至凋亡。同時(shí)線粒體氧化應(yīng)激也是衰老的重要機(jī)制和潛在干預(yù)靶點(diǎn)。在本研究中筆者發(fā)現(xiàn)在衰老過程中，線粒體功能下降，線粒體ROS 產(chǎn)生增加，而UA 能夠改善線粒體功能，減少線粒體ROS 生成，提高抗氧化酶活性，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而延緩細(xì)胞衰老，為UA 的抗衰老研究和進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。