新型蒽醌類拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑的深度學(xué)習(xí)設(shè)計(jì)與合成

沈泓佑, 何小妮, 魯素芳, 秦 箐, 郝二偉, 劉 旭*

(1. 廣西大學(xué) a. 化學(xué)化工學(xué)院; b. 醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530004； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530299)

拓?fù)洚悩?gòu)酶(Topoisomerase, Topo)為解DNA雙螺旋中拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)異常部分的酶。II型Topo可切割雙螺旋的兩條鏈而使超螺旋DNA解旋。同時(shí)拓?fù)洚悩?gòu)酶II型通過磷-酪氨酸鍵與DNA裂解的兩條鏈共價(jià)連接[1]。Topo II的抑制劑主要包括：鬼臼毒素類(依托泊苷、替尼泊苷等)、吖啶類和蒽醌類(阿霉素、米托蒽醌等)。其中，蒽醌類具有廣泛生物活性，并且表現(xiàn)出獨(dú)特的抗腫瘤作用[2]。但因嚴(yán)重副作用，如耐藥性、繼發(fā)性腫瘤和心臟毒性而臨床應(yīng)用受限[3-6]。因此，修飾其分子結(jié)構(gòu)，提高藥物生物利用度，降低對正常細(xì)胞的毒性，是亟待解決的實(shí)際問題。

大黃、茜草及蘆薈等中藥有一定抗腫瘤效果。其主要活性成份為具有蒽醌母核的大黃素、大黃酸及蘆薈大黃素。目前臨床上抗癌常用藥阿霉素及米托蒽醌的基本母核也包含蒽醌結(jié)構(gòu)[7]。蒽醌作為拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，可與拓?fù)洚悩?gòu)酶II結(jié)合，阻斷其對DAN復(fù)制的催化作用[8-10]。

本文根據(jù)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室前期工作[11-13]，收集整理了102個具有一定抗腫瘤活性蒽醌類衍生物。根據(jù)文獻(xiàn)中IC50值和藥理、毒性實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)、良、差和低毒、中毒、高毒標(biāo)示其活性與毒性。以最新的深度學(xué)習(xí)算法作為建模工具，分別建立其結(jié)構(gòu)特征與抗腫瘤活性、正常細(xì)胞毒性之間初步的定量構(gòu)效關(guān)系模型(QSAR Model)[14]。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用拼合原理等基本思路，設(shè)計(jì)了91個新衍生物。計(jì)算新衍生物的結(jié)構(gòu)特征，代入模型中，得到優(yōu)活性衍生物37個，低毒性衍生物29個，同時(shí)具有優(yōu)活性和低毒性的衍生物17個。又利用TOPO II作為受體靶標(biāo)(PDB代碼：1ZXM)，采用對接計(jì)算方法對17個新型1,4-二羥基蒽醌衍生物打分，取排名靠前且較易合成的化合物，以合適的方法進(jìn)行合成與純化，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和HR-MS(ESI)表征。最后進(jìn)行了體外抗腫瘤藥理和正常肝細(xì)胞L02毒理實(shí)驗(yàn)，對所得衍生物的抗腫瘤活性和毒性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

WRS-1B型熔點(diǎn)儀；Bruker 600 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；UPLCI-CLASS-XEVOVG2-X型高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀；Molecular operating Environment(MOE2010)軟件包；蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(http:/www.rcsb.org/pdb)。

所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 分子對接及QSAR建模

深度因子分解機(jī)(DeepFM)[15]為華為諾亞方舟實(shí)驗(yàn)室與哈爾濱工業(yè)大學(xué)開發(fā)的模型。其結(jié)構(gòu)大體由三部分組成：嵌入層(Embedding Layer)，因子分解機(jī)(Factorization Machines)，深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Deep Neural Net)。

圖1 深度因子分解機(jī)(DeepFM)模型的主要層次和連接特點(diǎn)Figure 1 Main hierarchy and connection characteristics of deep factor decomposer model

本文共收集了102個具蒽醌母核結(jié)構(gòu)的化合物(包括阿霉素及米托蒽醌)，以對不同腫瘤細(xì)胞的半數(shù)致死濃度IC50值為活性目標(biāo)數(shù)據(jù)區(qū)分優(yōu)、良、差三個活性區(qū)間。又以其對肝細(xì)胞等正常人體細(xì)胞的IC50值區(qū)分低毒、中毒、高毒。分子結(jié)構(gòu)特征選取了成藥五原則參數(shù)(氫鍵受體數(shù)，氫鍵給體數(shù)，分子量，油水分配系數(shù)，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù))，以及HOMO， LUMO能量值，水合能，分子體積和拓?fù)渲笖?shù)等作為訓(xùn)練參數(shù)(MOE軟件包計(jì)算得到)，以DeepFM分別建立QSAR活性與毒性模型。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，DeepFM隱藏層數(shù)設(shè)為16，每層隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)設(shè)為4。所得活性模型的留一法交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率為83，毒性模型為80.7%?？紤]到藥物的生物利用度和降低毒性等方面，本文引入磺?；桶吠榛Y(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了91個新型蒽醌衍生物。計(jì)算其結(jié)構(gòu)特征并代入上述模型得到虛擬的抗癌活性和正常細(xì)胞毒性，取其中優(yōu)活性和低毒性的交集，得到17個衍生物結(jié)構(gòu)。

以TOPO II作為靶標(biāo)對17個虛擬物再次篩選：以每化合物改變30次空間構(gòu)型和靶標(biāo)對接(MOE計(jì)算)，使用配體擴(kuò)張法獲得活性位點(diǎn)，采用柔性對接的方法，對接運(yùn)行次數(shù)每個1000次，以LONDG為打分函數(shù)。取打分值低于-13.00部分，結(jié)果有11個衍生物達(dá)到較優(yōu)分值標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 合成

(1) 1-(2，4-二氟-5-氯苯磺酸酯)-4-芐胺-9,10蒽醌(B)的合成取1,4-二羥基蒽醌252.85 mg(1 mmol)溶于乙腈4.8 mL中，加熱至回流，加入三乙胺0.74 mL和2,4-二氟-5-氯苯磺酰氯604.99 mg(2.4 mmol)，反應(yīng)2 h。加入7.2 mL水，冷卻至室溫，析出淡黃色晶體，過濾，濾餅烘干得淡黃色粉末B，收率82%, m.p.178.0～178.6 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.13～8.01(m, 4H), 7.79(dd,J=5.8 Hz, 3.3 Hz, 2H), 7.67(s, 2H), 7.16(t,J=8.6 Hz, 2H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.13, 163.13, 161.39, 159.61,157.86, 145.87, 134.51, 133.11, 130.86, 126.93, 121.70, 117.96, 107.27; HR-MS(ESI)m/z: cacld 682.9130, found 682.9326{[M-Na]+}。

Scheme 1

(2) 1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-丙胺基-9,10蒽醌(B1～B11)的合成通法取B661.37 mg(1mmol)溶于27.4 mL二氯甲烷中，加入胺烷(NH2-R)約60 mg(約1 mmol)，攪拌下反應(yīng)24 h。經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(二氯甲烷)/V(石油醚)=2/1]純化得淡黃色固體(B1～B11)。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-丙胺基-9,10蒽醌(B1): 淡黃色固體299.53 mg，收率61%, m.p.160.8～160.9 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.08～8.03(m, 3H), 7.80～7.74(m, 2H), 7.65(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.13(t,J=8.5 Hz, 1H), 3.15(td,J=7.1 Hz, 5.0 Hz, 2H), 1.75(h,J=7.3 Hz, 2H), 1.04(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.41, 180.23, 161.30, 150.55, 146.58, 145.52, 134.30, 134.15, 133.42, 133.14, 132.78, 131.08, 130.50, 128.47, 127.61, 126.95, 113.39, 108.98, 107.25, 97.85, 45.19, 22.00, 11.40; HR-MS(ESI)m/z: cacld 490.0406, found 490.0608{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-丁胺基-9,10蒽醌(B2): 淡黃色固體287.88 mg,收率57%, m.p.163.2～163.5 ℃;1H NMR(500 MHz, Chloroform-d)δ: 8.12～8.05(m, 3H), 7.83～7.77(m, 2H), 7.67(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.64(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.16(t,J=8.6 Hz, 1H), 6.40(q,J=3.8 Hz, 3.3 Hz, 1H), 3.20(td,J=7.1 Hz, 4.9 Hz, 2H), 1.77～1.69(m, 2H), 1.53～1.44(m, 2H), 1.00(t,J=7.4 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.41, 180.23, 161.14, 150.63, 146.58, 145.52, 134.29, 134.15, 133.43, 133.14, 132.78, 131.08, 130.50, 128.47, 127.61, 126.95, 113.37, 108.94, 107.25, 97.81, 43.23, 30.74, 20.10, 13.75; MSm/z: cacld 504.0562, found 504.0742{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-戊胺基-9,10蒽醌(B3): 淡黃色固體285.49 mg,收率55%, m.p.164.5～164.8 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.09～8.03(m, 3H), 7.81～7.75(m, 2H), 7.65(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.13(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.17(td,J=7.2 Hz, 4.9 Hz, 2H), 1.73(p,J=7.2 Hz, 2H), 1.39(tdd,J=15.5 Hz, 7.7 Hz, 2.7 Hz, 4H), 0.92(t,J=6.9 Hz, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.54, 180.35, 161.26, 150.74, 146.70, 145.64, 134.41, 134.27, 133.55, 133.27, 132.89, 131.20, 131.12, 130.62, 128.59, 127.73, 127.08, 113.49, 107.37, 97.93, 43.64, 29.16, 28.53, 22.46, 14.07; MSm/z: cacld 518.0719, found 518.0725{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-己胺基-9,10蒽醌(B4): 淡黃色固體266.54 mg,收率50%, m.p.168.1～168.4 ℃;1H NMR(500 MHz, Chloroform-d)δ: 8.05(dddd,J=13.0 Hz, 8.3 Hz, 5.3 Hz, 3.2 Hz, 3H), 7.82 ～7.74(m, 2H), 7.64(d,J=7.9 Hz, 1H), 7.61(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.13(t,J=8.6 Hz, 1H), 6.38(td,J=5.0 Hz, 2.0 Hz, 1H), 3.16(td,J=7.2 Hz, 5.0 Hz, 2H), 1.71(p,J=7.3 Hz, 2H), 1.46～1.38(m, 2H), 1.36～1.24(m, 4H), 0.93～0.85(m, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 180.41, 180.23, 161.14, 150.62, 146.58, 145.51, 134.29, 134.14, 133.43, 133.15, 132.77, 131.07, 130.50, 128.47, 127.61, 126.96, 113.36, 108.95, 107.24, 97.82, 43.55, 31.68, 28.92, 26.88, 22.57, 14.06; MSm/z: cacld 532.0875, found 532.0817{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-甲氧基丙胺基)-9,10蒽醌(B5): 淡黃色固體218.84 mg,收率42%, m.p.161.3～161.5 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.09～7.99(m, 3H), 7.76 ～7.71(m, 2H), 7.69(d,J=6.8 Hz, 1H), 7.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.12(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.55(t,J=5.4 Hz, 2H), 3.38(s, 3H), 3.25(q,J=5.9 Hz, 2H), 1.96～1.91(m, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.43, 180.24, 161.36, 150.99, 146.62, 145.49, 134.29, 134.11, 133.45, 133.15, 132.77, 131.07, 130.46, 128.52, 127.60, 126.97, 113.50, 108.41, 107.24, 97.47, 71.43, 58.93, 42.40, 28.27; MSm/z: cacld 520.0511, found 520.0428{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-乙氧基丙胺基)-9,10蒽醌(B6): 淡黃色固體214.02 mg,收率40%, m.p.151.4～151.8 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ8.09～8.00(m, 3H), 7.76 ～7.72(m, 2H), 7.69(d,J=6.8 Hz, 1H), 7.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.12(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.60(t,J=5.3 Hz, 2H), 3.51(q,J=7.0 Hz, 2H), 3.24(q,J=5.7 Hz, 2H), 1.98～1.92(m, 2H), 1.24(t,J=7.0 Hz, 3H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.43, 180.24, 159.32, 151.04, 146.63, 145.49, 134.29, 134.10, 133.45, 133.14, 132.78, 131.08, 130.45, 128.54, 127.60, 126.97, 113.50, 108.25, 107.24, 97.42, 69.68, 66.83, 42.82, 28.33, 15.25; MSm/z: cacld 534.0668, found 534.0628{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-苯基丙胺基)-9,10蒽醌(B7): 淡黃色固體215.48 mg,收率38%, m.p.163.5～163.7 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.00(td,J=8.5 Hz, 7.3 Hz, 4.9 Hz, 2H), 7.84～7.77(m, 3H), 7.65(d,J=1.5 Hz, 2H), 7.37(d,J=7.0 Hz, 1H), 7.30(dd,J=8.3 Hz, 6.9 Hz, 2H), 7.22～7.18(m, 3H), 3.15～3.08(m, 2H), 2.58(t,J=7.7 Hz, 2H), 1.73～1.66(m, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.40, 180.22, 161.26, 150.47, 146.56, 145.52, 140.43, 134.29, 134.16, 133.41, 133.13, 132.76, 131.07, 130.49, 128.74, 128.45, 128.34, 127.62, 126.93, 126.78, 126.48, 113.42, 109.06, 107.25, 97.65, 77.30, 42.77, 33.01, 30.01; MSm/z: cacld 566.0719, found 566.0738{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3,3-二苯基丙胺基)-9,10蒽醌(B8): 淡黃色固體276.53 mg,收率43%, m.p.171.2～171.4 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 8.01～7.95(m, 2H), 7.77～7.71(m, 3H), 7.63(s, 2H), 7.35(d,J=7.0 Hz, 1H), 7.32～7.26(m, 8H), 7.18(tp,J=5.9 Hz, 3.1 Hz, 2H), 4.00(t,J=7.7 Hz, 1H), 3.03～2.97(m, 2H), 2.17(q,J=7.9 Hz, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.40, 180.23, 161.22, 150.27, 146.55, 145.51, 143.52, 134.29, 134.17, 133.40, 133.13, 132.76, 131.04, 130.49, 128.88, 128.44, 127.62, 126.93, 126.85, 126.78, 113.45, 109.18, 107.25, 97.89, 48.89, 42.14, 34.38; MSm/z: cacld 642.1032, found 642.1124{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-嗎啉基丙胺基)-9,10蒽醌(B9): 淡黃色固體195.87 mg,收率34%, m.p.143.1～143.3℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.12～8.05(m, 3H), 7.83 ～7.77(m, 2H), 7.64(d,J=8.6 Hz, 2H), 7.16(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.76(t,J=4.6 Hz, 4H), 3.32(q,J=6.4 Hz, 2H), 2.49(dd,J=15.7 Hz, 9.2 Hz, 6H), 1.91(p,J=6.6 Hz, 2H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.40, 180.16, 162.15, 148.34, 146.09, 145.73, 134.50, 134.45, 133.33, 133.21, 132.74, 131.16, 130.71, 128.60, 127.70, 126.95, 126.84, 111.82, 107.27, 107.13, 100.35, 77.29, 66.81, 56.13, 53.81, 42.18, 25.27; MSm/z: cacld 575.0933, found 575.0914{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(4-氨基丁醛二甲縮醛基)-9,10蒽醌(B10): 淡黃色固體231.68 mg,收率41%, m.p.134.2～134.5 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.11～8.03(m, 3H), 7.78 ～7.75(m, 2H), 7.73(d,J=6.8 Hz, 1H), 7.63(d,J=9.1 Hz, 1H), 7.15(t,J=8.6 Hz, 1H), 4.43(t,J=4.9 Hz, 1H), 3.39(s, 6H), 3.20(q,J=6.2 Hz, 2H), 1.76(pt,J=7.2 Hz, 3.8 Hz, 4H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.42, 180.25, 161.30, 150.65, 146.58, 145.51, 134.32, 134.16, 133.42, 133.14, 132.77, 131.05, 130.49, 127.62, 126.96, 126.77, 113.43, 108.99, 107.25, 104.19, 97.86, 53.42, 43.34, 29.87, 23.39; MSm/z: cacld 564.0774, found 564.0618{[M-H]-}。

1-(2,4-二氟-5-氯苯磺酸酯基)-4-(3-(二丁胺)丙胺基)-9,10蒽醌(B11): 淡黃色固體296.72 mg,收率48%, m.p.100.6～100.8 ℃;1H NMR(600 MHz, Chloroform-d)δ: 8.10～8.00(m, 3H), 7.73(dd,J=5.8 Hz, 3.3 Hz, 2H), 7.67(d,J=6.9 Hz, 1H), 7.60(d,J=9.0 Hz, 1H), 7.12(t,J=8.6 Hz, 1H), 3.21(q,J=5.5 Hz, 2H), 2.60(s, 2H), 2.45(t,J=8.0 Hz, 4H), 1.81(s, 2H), 1.45(p,J=7.8 Hz, 4H), 1.29(h,J=7.4 Hz, 4H), 0.91(t,J=7.3 Hz, 6H);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 180.46, 180.26, 159.34, 151.43, 146.70, 145.45, 134.26, 134.07, 133.49, 133.16, 132.79, 131.03, 130.88, 130.42, 128.57, 126.99, 126.74, 113.54, 107.23, 97.10, 54.04, 53.49, 44.28, 28.55, 24.75, 20.85, 14.09; MSm/z: cacld 617.1767, found 617.1723{[M-H]-}。

1.4 生物活性測試

使用MTS法測定所有化合物對DU-145、 HELA、 HEPG-2癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞L02的體外細(xì)胞毒性。以1,4-二羥基蒽和5-FU為對照。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物活性

表1為目標(biāo)化合物的體外細(xì)胞毒性。由表1可知，與1,4-二羥基蒽醌相比，B1～B11的抗癌活性明顯增強(qiáng)，尤其是B6和B11對DU-145具有顯著的抑制作用，其IC50分別為16.88 μM和5.48 μM。

表1 化合物的體外抗腫瘤活性*Table 1 In vitro antitumor activities

表2 化合物的分子對接結(jié)果Table 2 The molecular docking results

圖2 化合物B11與拓?fù)洚悩?gòu)酶II的相互作用Figure 2 Interactions of B11 and Topo II

2.2 分子對接分析

分子對接結(jié)果見表2，以化合物B11為實(shí)例，對其與Topo II受體的結(jié)合相互作用進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。由表2和圖2可知，B11與DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II的結(jié)合吉布斯自由能為-16.06 kcal/mol，優(yōu)于醌茜(-7.11 kcal/mol)；從口袋形狀看，B11能較好地與Topo II活性位點(diǎn)吻合；其拓展取代基團(tuán)通過氫鍵相互作用與口袋內(nèi)的兩個氨基酸殘基(Asn B91和Tyr A34)有強(qiáng)關(guān)聯(lián)；蒽醌的刀片式平面有利于切入與Topo II作用的DNA鏈中。

以QSAR模型和對接計(jì)算為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并合成了11個蒽醌衍生物(B1～B11)。體外活性測試結(jié)果表明，活性最佳的化合物為B11，對DU-145的IC50為5.48 μmol/L。并結(jié)合藥理實(shí)驗(yàn)和對接圖，對B11與靶點(diǎn)的相互作用進(jìn)行分析，闡述了其可能的分子機(jī)制。