昆蟲病原線蟲共生菌NK水懸浮劑的研制

廖春麗，楊 溢，袁 源，杜江南，樊星照，桑明博，朱 菁，李冰冰

（1.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南平頂山467036；2.河南城建學(xué)院河南省水體污染防治與修復(fù)重點實驗室，河南平頂山467036）

眾所周知，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，不僅給人類自身的健康帶來威脅，而且使很多害蟲產(chǎn)生顯著的抗藥性，許多地方甚至陷入農(nóng)藥越用越多、蟲害愈演愈烈的惡性循環(huán)。同時，農(nóng)藥殘留也導(dǎo)致土壤和水資源污染、農(nóng)業(yè)生物多樣性被破壞等一系列的生態(tài)、環(huán)境和社會問題。因此，尋求新的安全、有效、可持續(xù)控制害蟲方法——生物防治，成為各國研究的重點。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）對多種害蟲具有特異殺蟲活性，具有高效、安全及特異性強等特點［1-2］，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治［3］，而且商業(yè)化應(yīng)用的殺蟲蛋白基因也主要來源于Bt。隨著Bt菌制劑的大規(guī)模應(yīng)用和表達Bt轉(zhuǎn)基因植物的大面積種植，導(dǎo)致Bt抗性昆蟲種群的快速發(fā)展。因此，開發(fā)新的生物殺蟲毒素已成為當務(wù)之急［4］。

目前已描述的昆蟲病原線蟲共生菌分為三個屬：致病桿菌屬（Xenorhabdus）、發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus）和嗜線蟲沙雷氏菌（Serratia nematodiphila）［5-7］。本課題組從平頂山地區(qū)采集的異小桿屬昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)分離到2株具有較高殺蟲活性的共生菌株LY2W 和NK，通過其形態(tài)、培養(yǎng)和生理生化特征并結(jié)合16S rDNA序列分析等手段將其鑒定為腸桿菌屬（Enterobacter），為昆蟲病原線蟲共生菌活菌制劑的研制奠定基礎(chǔ)。

昆蟲病原線蟲共生菌用于有害生物的防治，需要形成一定形態(tài)的制劑才能夠被應(yīng)用［8-9］。關(guān)于共生菌殺蟲活性的農(nóng)藥劑型還鮮有報道，只在李立濤［9］的研究中，嗜線蟲致病桿菌制劑對小菜蛾有良好的防治效果，50倍、100倍和200倍稀釋液對3齡小菜蛾72 h的防治效果分別為97.56%、90.24%和80.49%。因此加強昆蟲病原線蟲活菌制劑的應(yīng)用研究，在未來農(nóng)業(yè)害蟲綜合防治中將發(fā)揮重要作用。本研究旨在從昆蟲病原線蟲共生菌活菌制劑所需各種助劑，如紫外光保護劑、濕潤分散劑、增稠劑、防腐劑中，篩選出適合微生物活體自身屬性的助劑，以增強制劑中微生物體抵抗外界環(huán)境的能力，延長產(chǎn)品的使用期，保證其防治效果［10］，同時增加共生菌殺蟲活性的農(nóng)藥劑型。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲與共生菌

①供試昆蟲：3齡大蠟螟幼蟲，網(wǎng)上購買，避光條件，濕度70%，溫度25℃靜置培養(yǎng)。②昆蟲病原線蟲共生菌：共生菌NK由本課題組提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要藥品

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖18.0 g、蛋白胨36.0 g、硫酸鈉4.5 g、硫酸鎂3.9 g、磷酸二氫鉀2.16 g、硫酸銨6.9 g、磷酸氫二鉀2.34 g、蒸餾水3 L，調(diào)pH值至7.2～7.4；濕潤分散劑：木質(zhì)素磺酸鈉、乳化劑OP-10、吐溫80、乳化劑500＃、乳化劑600＃；增稠劑：羧甲基纖維素鈉、黃原膠、聚乙烯醇、阿拉伯膠；紫外光保護劑：全脂牛奶、活性炭、木質(zhì)素磺酸鈉；防腐劑：山梨酸鉀、尼泊金甲醋、脫氫醋酸鈉；防凍劑：乙二醇；消泡劑：有機硅。

1.1.3 主要儀器

低溫高速離心機（GL-21M）、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZYW-2102C）、生化恒溫培養(yǎng)箱（SHP-250）、超聲波破碎儀（SCIENTZ-ⅡD）、高壓蒸汽滅菌鍋（GI60 DR）、恒溫水浴鍋（HH-S4）。

1.2 方法

1.2.1 菌體濃度的確定

將共生菌菌體沉淀用無菌蒸餾水分別配置成濃度40%、50%、60%、70%的菌懸液，以生理鹽水作為對照，飼喂3齡大蠟螟幼蟲，每個濃度飼喂20條大蠟螟幼蟲，設(shè)置三個重復(fù)，觀察大蠟螟幼蟲死亡數(shù)，計算死亡率和校正死亡率［5］，選擇殺蟲活性最佳的共生菌濃度。

1.2.2 以殺蟲活性為指標初篩各種助劑

共計對18種助劑進行篩選。分別配制10 mL 60%菌液+助劑、10 mL 60%菌液、10 mL生理鹽水。每種樣品飼喂20條3齡大蠟螟幼蟲，設(shè)置三個重復(fù)。記錄蟲子的死亡情況。以殺蟲活性為指標排除對其影響較大的助劑，達到初篩的目的。

1.2.3 復(fù)篩各種助劑以及確定其最佳濃度

濕潤分散劑的復(fù)篩及濃度的確定、防腐劑的復(fù)篩、增稠劑的選擇、紫外光保護劑的選擇及濃度的確定均參考文獻［9］。懸浮率測定參照《農(nóng)藥懸浮率測定方法》（GB/T14825-2006），冷儲穩(wěn)定性測定參照《農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測定方法》（GB/T19137-2003）。

1.2.4 共生菌NK水懸浮劑的活性檢測

將共生菌NK水懸浮劑原液分別稀釋10倍、50倍、100倍，加上原液共得到四組共生菌水懸浮劑，以生理鹽水作為對照，飼喂3齡大蠟螟幼蟲，通過觀察幼蟲死亡率檢驗共生菌水懸浮劑防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體濃度篩選結(jié)果

菌體濃度初篩結(jié)果如圖1所示，當菌體濃度為60%時，在7～8 d校正死亡率穩(wěn)定達到55.56%。因此，確定水懸浮劑中菌體濃度為60%。（注：折線圖數(shù)值代表均值±標準誤差，顯著水平P≤0.05，下同）。

2.2 助劑初篩結(jié)果

各種助劑初篩結(jié)果如圖2～圖5所示。

圖1 水懸浮劑中菌體濃度的初篩結(jié)果

圖2 濕潤分散劑初篩的確定

圖3 防腐劑初篩的確定

圖4 增稠劑初篩的確定

圖5 紫外光保護劑、消泡劑、防凍劑初篩的確定

圖2～圖5反映各助劑與60%共生菌NK菌液以一定比例混合后隨著時間的延長對3齡大蠟螟幼蟲校正死亡率的影響。分析可知，蟲子的死亡率都隨著時間延長而增加，到7 d達到最高，8 d達到穩(wěn)定。如圖2所示，濕潤分散劑吐溫遠遠低于60%菌液校正死亡率，對菌液的殺蟲活性明顯具有抑制作用，在本次篩選過程中將其淘汰。而圖3中，防腐劑的三種助劑均高于60%菌液的效果，在本次篩選中三者都保留。在圖4中，增稠劑阿拉伯膠始終低于60%菌液校正死亡率，因此將其淘汰，而保留其他增稠劑。在圖5中，消泡劑有機硅、防凍劑和丙三醇校正死亡率與60%菌液相比具有較好的增效作用，確定它們?yōu)樽罴训南輨┖头纼鰟?。紫外光保護劑木質(zhì)素磺酸鈉校正死亡率從第2天開始就低于60%菌液，因此將其淘汰，而保留具有增效作用的全脂奶粉和活性炭。

2.3 助劑復(fù)篩結(jié)果

2.3.1 濕潤分散劑的復(fù)篩結(jié)果以及濃度配比的確定

根據(jù)圖2結(jié)果對4種濕潤分散劑進行復(fù)篩，結(jié)果如表1所示，根據(jù)懸浮率淘汰了乳化劑500＃，根據(jù)分散性淘汰了木質(zhì)素磺酸鈉。本試驗篩選得到兩種相對較好的濕潤分散劑OP-10和乳化劑600＃，懸浮率均在91%以上。

表1 濕潤分散劑的復(fù)篩結(jié)果

最佳濕潤分散劑濃度配比的篩選結(jié)果見表2，根據(jù)懸浮率結(jié)果，當濃度比為2:4和4:2時，其懸浮率均達到90%以上。結(jié)合成本以及分散性考慮，最終確定其濃度配比為分散劑OP-10與乳化劑600＃比例為4:2時具有良好的增效效果。

表2 最佳濕潤分散劑濃度配比的篩選結(jié)果

2.3.2 防腐劑的復(fù)篩結(jié)果

各防腐劑濃度如表3所示。

表3 各防腐劑濃度

根據(jù)圖3結(jié)果對三種防腐劑進行防腐劑復(fù)篩，如表4、表5所示，根據(jù)正交試驗得出各防腐劑復(fù)合配方的防腐效果差異較大，通過極差法分析，山梨酸鉀、尼泊金甲酯和脫氫醋酸鈉對應(yīng)的極差值分別是55.56、33.32和77.77，說明脫氫醋酸鈉的防腐效果最好，山梨酸鉀次之，尼泊金甲酯較差。防腐效果累計值越大表示防腐效果越好，在進行防腐劑濃度水平選擇時，選擇防腐效果累計值最大所對應(yīng)的濃度水平。如表3所示，0.2%山梨酸鉀、0.03%尼泊金甲酯和0.2%脫氫醋酸鈉的復(fù)合配方的防腐效果最好。

表4 正交試驗對制劑的防腐效果

表5 各組防腐劑防腐效果的累計值

表6 最佳增稠劑的復(fù)篩結(jié)果

2.3.3 增稠劑的復(fù)篩結(jié)果

根據(jù)圖4結(jié)果對三種增稠劑進行增稠劑復(fù)篩，增稠劑的復(fù)篩結(jié)果見表6，黃原膠懸浮率最大，且當黃原膠濃度為0.2%時，懸浮率最大；三種增稠劑各濃度的傾倒性只有0.2%黃原膠、0.05%聚乙烯醇和0.05%羧甲基纖維素鈉合格。通過比較離心穩(wěn)定性和冷貯穩(wěn)定性，篩選最佳增稠劑為0.2%的黃原膠。

2.3.4 紫外光保護劑的復(fù)篩結(jié)果以及最佳濃度的確定

無論是化學(xué)農(nóng)藥還是生物農(nóng)藥，都容易受到陽光中的紫外光照射影響，導(dǎo)致殺蟲活性降低。因此，篩選有效的紫外光保護劑已成為現(xiàn)代農(nóng)藥延長其持效期的重要手段。紫外光保護劑照射時間對殺蟲效果的影響如圖6所示。

圖6 紫外光保護劑不同時間對共生菌殺蟲效果的影響

由圖6可知，隨著照射時間（30 min、1 h、2 h、4 h、6 h）的延長，60%菌液的殺蟲效果逐漸下降，而加入全脂奶粉和活性炭的菌液殺蟲效果依然很好，且全脂奶粉的殺蟲活性均高于活性炭，因此本實驗最佳紫外光保護劑為全脂奶粉。

如圖7所示，加入不同濃度的全脂奶粉，都能對菌體起到一定的保護作用，但是當全脂奶粉濃度為3%時，紫外光照射幾乎不影響菌體的殺蟲活性，因此，本實驗選擇最佳的紫外光保護劑為3%的全脂奶粉。

2.4 共生菌水懸浮劑最優(yōu)配方

2.4.1 共生菌NK水懸浮劑性能指標檢測結(jié)果

共生菌NK水懸浮劑檢測結(jié)果如表7所示，共生菌NK水懸浮劑的最優(yōu)配方為：細胞沉淀60%、山梨酸鉀0.2%、尼泊金甲酯0.03%、脫氫醋酸鈉0.2%、乳化劑OP-10為4%、乳化劑600＃2%、全脂奶粉3%、黃原膠0.2%、乙二醇5%、有機硅0.6%和水24.77%，其懸浮率達到90.56%，具有良好的離心穩(wěn)定性和傾倒性；經(jīng)過一周的冷貯靜置，并無分層和析水現(xiàn)象，具有較好的冷貯穩(wěn)定性。綜上所述，昆蟲病原線蟲共生菌NK水懸浮劑各項性能指標良好。

圖7 全脂奶粉的確定

表7 共生菌NK水懸浮劑性能指標檢測結(jié)果

2.4.2 共生菌NK水懸浮劑的活性檢測結(jié)果

共生菌NK水懸浮劑的活性檢測結(jié)果如圖8所示，由圖8可知，共生菌NK水懸浮劑原液和10倍、50倍、100倍稀釋液的校正死亡率分別是100%、88.89%、77.78%和61.11%，綜合各方面因素考慮，推薦昆蟲病原線蟲共生菌NK水懸浮劑的使用濃度為10～50倍稀釋液。

圖8 共生菌水懸浮劑稀釋液殺蟲活性檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本次實驗得出均符合各項指標要求的共生菌NK水懸劑最優(yōu)配方：細胞沉淀60%、山梨酸鉀0.2%、尼泊金甲酯0.03%、脫氫醋酸鈉0.2%、乳化劑OP-10 4%、乳化劑600＃2%、全脂奶粉3%、黃原膠0.2%、甘油5%、有機硅0.6%和水24.77%，而且室內(nèi)殺蟲效果好。共生菌NK水懸浮劑稀釋50倍，殺蟲效果能達到77.78%。但和同類嗜線蟲致病桿菌制劑對小菜蛾防治效果方面對比，共生菌NK水懸劑對大蠟螟的防治效果基本一樣，但是本實驗性能指標比嗜線蟲致病桿菌制劑好，只是成本略高。其原因可能是本實驗對象大蠟螟蟲個體大，致死時間長，而在實際應(yīng)用中針對韭蛆等個體小的害蟲，配方可能還需要改變和完善。本實驗研究增加了共生菌殺蟲活性的農(nóng)藥劑型。后續(xù)將進行韭菜田間試驗，從韭菜長勢、韭菜害蟲-韭蛆死亡情況及生物安全性等方面進行綜合評價生物防菌活菌制劑的效果，研究出對韭蛆等害蟲高效、環(huán)境安全、低成本和易保存的生物農(nóng)藥。