甲狀腺球蛋白增高的先天性甲狀腺功能減退癥1 例報告并文獻復習

王立彪 劉玉慧 相恒杰 黃文龍 陳文霞

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家兒童區(qū)域醫(yī)療中心（河南鄭州 450000）

先天性甲狀腺功能減退癥（congenital hypothyroidism，CH）是新生兒和嬰兒常見的一種內分泌系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約1/2000～1/4000，其中由甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）基因缺陷導致的CH患者較罕見，這類患者血清TG水平多降低或缺乏，但極少數患者TG水平升高。本文報告1個血清TG水平增高CH家系的臨床資料。

1 臨床資料

河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院收治的1例45日齡黃疸女嬰?；純合礕 3 P 2，孕38 周順產，出身體質量2 800 g，生后Apgar評分1分鐘、5分鐘均為10分，臍帶、胎盤未見明顯異常。患兒母親孕期無高危因素，生后當天即出院?；純荷笳ｉ_奶，奶量完成可?；純荷? 天出現顏面皮膚黃染，具體膽紅素值不詳。家屬自行給予益生菌口服治療，黃疸逐漸加重。15 日齡時患兒仍全身皮膚黃疸，伴鞏膜稍黃染，至當地醫(yī)院經皮測膽紅素為10.4 mg/dL，繼續(xù)口服益生菌治療。但黃疸消褪不理想，伴黃綠色糊狀便，3 天1 次。當地醫(yī)院查總膽紅素208.9 μmol/L，直接膽紅素12.4 μmol/L，白蛋白41.3 g/L，遂轉入院。入院體格檢查：神清，精神反應可，無特殊面容，全身皮膚黏膜輕度黃染伴鞏膜稍黃染，心肺腹未見明顯異常，神經系統(tǒng)無異常。入院實驗室檢查：游離三碘甲腺原氨酸（FT3）2.95 pmol/L，游離甲狀腺素（FT4）0.01 pmol/L，促甲狀腺素（TSH）354.75 mIU/L，甲狀腺球蛋白（TG）377.68 ng/mL，抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPO-Ab）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TG-Ab）、促甲狀腺受體抗體（TSHR-Ab）均無異常；血常規(guī)、C 反應蛋白、降鈣素原（PCT）、腎功能、心肌酶、電解質、優(yōu)生優(yōu)育十項（弓形蟲、巨細胞病毒、風疹病毒、單純皰疹病毒1型及單純皰疹病毒2型5種病原的IgG、IgM抗體）及EB病毒四項（EBV衣殼抗原IgG、EBV早期抗原IgG、EBV核抗原IgG、EBV 衣殼抗原IgM）等相關檢查未見明顯異常。甲狀腺超聲示甲狀腺形態(tài)正常，無結節(jié)、囊腫。患兒診斷為CH。予左甲狀腺素鈉片替代治療3 個月后，患兒甲狀腺功能及甲狀腺球蛋白恢復正常（FT 3 6.32 pmol/L，FT4 14.82 pmol/L，TSH 0.65 mIU/L，TG 3.02 ng/mL）。家族中無甲狀腺相關疾病史，父母及哥哥均無異常（表1）。

因家屬要求明確CH 原因及預測是否需終身服藥，經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準以及家屬知情同意后，用EDTA 抗凝采血管采集患兒兄妹及其父母外周血，送至北京金準基因科技有限責任公司進行相關基因檢測。使用血液提取試劑盒（Blood DNA Kit V 2，CW 2553，康為世紀）提取基因組 DNA，并對基因組 DNA 進行質控。對DNA 樣本進行超聲破碎、文庫構建、雜交捕獲（SureSelect 雜交緩沖液體系，Agilent）及擴增、純化，建立患兒的DNA目標基因捕獲文庫。后使用 Qubit dsDNA HS Assay kit（Invitrogen,Q32851）對測序文庫的 DNA 樣本進行定量。按照捕獲文庫DNA樣本濃度及測序深度要求，使用Illumina HiSeq X Ten 平臺進行測序，平均測序深度為 100×，獲得fastq 格式的原始數據。使用Burrows-Wheeler Alignment（v0.7.15）工具將測序reads 比對到人類參考基因組（hg 19 版）。使用GATK（v 3.6）、CODEX、XHMM（v 1.0）、KSCNV（康旭開發(fā)）等軟件檢測單核苷酸變異（SNV）、小的插入缺失變異（InDel）及可能存在的拷貝數變異（CNV）。參考1000 G（V 1，V 3）、dbSNP、ESP 6500、ExAC、RefSeq、Ensembl、UCSC 等公共數據庫，對變異信息進行注釋。使用 PolyPhen-2、SIFT 和 MutationTaster2等軟件對變異進行蛋白功能損傷預測。參考 OMIM、HGMD、ClinVar 等數據庫，進行疾病信息注釋。經 GERP++保守性分析和過濾，保留可能與疾病有關的變異。對各樣本位點進行一代驗證。在人類基因組數據庫 GenBank 中獲得上述變異位點基因序列，在引物設計網站Primer Z（http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/primerz 4 .do）設計引物并合成。對變異位點進行PCR擴增后行Sanger測序，將獲得序列與之前的序列進行比對，排除二代測序中假陽性位點。

基因檢測結果：在患兒TG 基因上發(fā)現2 個復合雜合變異，其中父源變異c.2149 C>T 導致編譯第717 號氨基酸精氨酸（R）的密碼子變?yōu)榻K止密碼子（p.R 717*），從而導致肽鏈合成提前終止。根據美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會遺傳變異分類標準與指南（ACMG）分類為疑似致病變異；母源變異c.5401+113 A>G 為剪切位點變異，可能影響mRNA剪接，ACMG分類為臨床意義未明變異?；純焊绺鐢y帶c.5401+113A>G單雜合變異，患者父母均為攜帶者，哥哥及父母的FT3、FT4、TSH、TG、TPO-Ab、TG-Ab、TSHR-Ab 檢查結果正常且并無甲狀腺功能減退相關癥狀。由于TG基因變異c.2149C>T及c.5401+113A>G在HGMD數據庫中未見報道，為新發(fā)現的TG基因變異位點（圖1、圖2）。

2 討論

CH 是新生兒和嬰兒中常見的一種內分泌疾病，為常染色體隱性遺傳，發(fā)病率約1/4000～1/2000，其中85%是由于甲狀腺分化、遷移或生長異常（甲狀腺發(fā)育不全）和促甲狀腺激素抵抗引起，15%是由于甲狀腺激素合成過程出現缺陷導致激素生成異常引起[1]。本例患兒的父母及哥哥均攜帶1個TG變異位點，無臨床癥狀；患兒則為復合雜合變異，出現明顯的甲狀腺功能減退，符合常染色體隱性遺傳方式。

表1 患兒家系臨床表型

圖1 TG 基因c.2149C ＞T 測序圖

圖2 TG 基因c.5401+113A ＞G 測序圖

TG是一種相對分子質量為660 000的同型二聚體糖蛋白，僅在甲狀腺中合成，是甲狀腺激素生物合成的高度專門化基質，在甲狀腺激素合成過程中TG 不僅為T3、T4合成提供骨架，同時可起到儲存碘和甲狀腺激素的作用[2]。TG 基因位于人類8 q 24.2-8 q 24.3染色體上，長度約270 kb，包含48個外顯子，其結構異?？赡軐е耇G 的合成或功能異常[3-5]。自1991 年首次報道TG基因變異可引起CH以來[6]，目前已發(fā)現100多種不同的TG基因變異類型[2,7]，但TG基因變異導致的CH仍較為罕見，發(fā)病率約為1/100 000[8]。

大多數由TG 基因變異而導致的CH 患者在左甲狀腺素替代治療前，不管是否存在甲狀腺腫大，都顯示出血清TG 水平降低或缺乏，這也是診斷TG基因缺陷的關鍵因素[7,9]。本例患兒出現極其罕見的臨床表型，血清TG 水平不僅沒有降低，反而升高。檢索文獻，除本例外，僅有4 例TG 升高的CH 患者的報道[10-12]。約80%的TG單體一級結構是三個連續(xù)的半胱氨酸（cysteine，Cys）重復結構域（重復結構域 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），剩余的20%（構成分子的羧基末端結構域）與乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）具有驚人的同源性，并且可能充當分子伴侶的作用。通常情況下，TG 基因變異可引起其轉錄產物不能正確的折疊，導致TG 蛋白在內質網的滯留，不能分泌到血液中，導致CH，此類患者多伴有甲狀腺腫和內質網累積病[11,13]。未正確折疊的TG蛋白不能在細胞內運輸，然后被伴侶蛋白通過未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）的細胞內信號通路重新折疊或降解[14]。文獻報道的4 例TG 增高病例中，變異所致氨基酸改變p.G 2322 S 和p.A 2215 D 位于膽堿酯酶樣（cholinesterase-like，ChEL）結構域中，p.C1995S位于Cys重復結構域Ⅲ中，均可引起TG錯誤折疊，并且在p.C 1995 S 伴TG 增高的病例中觀察到缺乏伴侶蛋白激活，因而導致不完全的UPR 使錯誤折疊的TG釋放入血，導致血清TG升高[10-12]。由此推測c.2149 C>T及c.5401+113 A>G 基因變異，可能引起TG 基因類似結構域改變，導致血清TG升高。此外CH患者甲狀腺功能一般多表現為TSH增高，而既往4例病例中僅p.G2322S氨基酸改變者出現TSH增高，剩余3例TSH均未見明顯異常。其中p.A 2215 D 氨基酸改變者為1 例男性患者，10 歲時因甲狀腺腫大行部分甲狀腺切除術，34 歲時再次因甲狀腺腫大行甲狀腺全切術，臨床病理表現為濾泡增生，甲狀腺碘攝取率明顯升高，且經重組人TSH 刺激后血清TG 無明顯升高；而p.C 1995 S 氨基酸改變者為2 例腺瘤性甲狀腺腫的成年姐妹，甲狀腺碘攝取率也明顯升高。這3 例患者均考慮存在TG基因異常導致的CH，其中p.A2215D變異者變異的TG分子能夠部分從內質網逃逸并合成少量的甲狀腺激素，這或許可以部分解釋為何攜帶TG基因變異的部分CH患者甲狀腺功能仍為正常。

總之，發(fā)現TG 基因的兩個新的變異，該復合雜合變異導致CH 患者血清TG 水平升高且不伴有甲狀腺腫大，其原因可能與TG 折疊錯誤或不完全的UPR有關。