COA6 基因新發(fā)變異致嬰兒細胞色素 c 氧化酶缺陷致心腦肌病4 型 1 例報告并文獻復習

崔清洋 尚 云 曹銀利 唐成和 石計朋

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院兒科（河南衛(wèi)輝 453100）

基因變異干擾線粒體呼吸鏈（mitochondrial respiratory chain，MRC）功能所致的線粒體呼吸鏈疾?。∕RC disease，MRCD）是一種最常見的先天性疾病之一，發(fā)病率估計為1:5000活產(chǎn)兒。MRCD為基因異質(zhì)性疾病，可由線粒體和/或核基因變異引起。已知的MRC缺陷已經(jīng)擴展到110個基因，且隨著測序技術(shù)的進步，這個數(shù)值還在快速增長。

復合體Ⅳ（細胞色素 c 氧化酶，cytochrome c oxidase，CcO）是呼吸鏈的末端酶，負責把電子從細胞色素c轉(zhuǎn)移到分子氧，由13個多肽亞基組成，其中3個亞基由線粒體基因編碼，其他10個為核基因編碼。細胞色素氧化酶復合體中的3種線粒體編碼蛋白質(zhì)是執(zhí)行電子傳遞功能的實際催化亞單位?？蓪е翪cO缺陷者包括核編碼的基因和線粒體編碼的基因，其中線粒體編碼基因有MT-CO1、MT-CO2、MT-CO3、MT-TS1及MT-TL1，核編碼基因有COX10、COX6B1、SCO1、C 12 ORF 62、COX 20、APOPT 1、COA 3、COX 8 A、COX 6 A 2、COX 4 I 1、COXFA 4、PET 117 和COX 5 A。而與致死性嬰兒心腦肌病尤為關(guān)聯(lián)的基因為 SCO2、COX15、COA5和COA6。

嬰兒細胞色素 c 氧化酶缺陷致心腦肌病4 型（infantile cardioencephalomyopathy due to cytochrome c oxidase deficiency-4，CEMCOX4）是一種呈常染色體隱性遺傳的線粒體疾病，由常染色體1q42上的COA6基因純合或復合雜合變異所致，其特征是在宮內(nèi)或出生后的前幾天發(fā)病，臨床特征為心肌病、腦肌病、骨骼肌肌病、Leigh綜合征、代謝性酸中毒和偶發(fā)的肝衰竭；此外大多數(shù)患兒還表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)異常，如呼吸異常、眼球震顫和腦回異常，均符合腦病。這種疾病通常在嬰兒早期是致命的。目前尚無CEMCOX4的發(fā)病率報道，國際上均為個案報道，國內(nèi)尚無報告。本文回顧分析1例CEMCOX4患兒的臨床資料及基因檢測結(jié)果，并首次報道COA6基因c.411_412insAAAG純合變異。

1 臨床資料

女性患兒，5 日齡，因呼吸困難5 天、加重6 小時入院?；純河诔錾蟛痪眉闯霈F(xiàn)呼吸困難，無發(fā)熱及呻吟，無腹部平坦或凹陷，就診于當?shù)蒯t(yī)院予經(jīng)鼻持續(xù)氣道正壓通氣（nasal continuous positive airway pressure，nCPAP）及抗感染治療4 天后呼吸困難減輕，予鼻導管吸氧后經(jīng)皮血氧飽和度尚穩(wěn)定。入院前6 小時患兒呼吸困難再次加重，予氣管插管及呼吸機輔助通氣下轉(zhuǎn)入新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院。患兒系G 1 P 1，足月順產(chǎn)，無產(chǎn)傷及窒息史。父母均體健，非近親結(jié)婚。體格檢查：呼吸45 次/min，心率無，予心肺復蘇后心率恢復正常，一般情況及反應(yīng)差，肢體少動，面色青灰，全身皮膚發(fā)花，肢體末端涼，皮膚彈性稍差，雙側(cè)瞳孔對光反射遲鈍，氣管插管下呼吸費力，吸氣三凹征陽性，雙肺未聞及明顯啰音，心音亢進，心前區(qū)可聞及Ⅲ/6 收縮期吹風樣雜音，肝臟肋下4 cm，質(zhì)軟，腸鳴音未聞及，四肢肌張力低下，原始反射未引出。實驗室檢查：血氣分析示代謝性酸中毒及高乳酸血癥，碳酸氫鈉治療后多次復查均提示高乳酸血癥；血常規(guī)白細胞16.5×109/L，紅細胞 4.13 × 1012/L，血紅蛋白158 g/L，血小板128×109/L；大小便常規(guī)未見異常；肝功能、電解質(zhì)未見異常；尿素13.73 mmol/L，尿酸408 μmol/L，肌酐85.4 μmol/L；乳酸脫氫酶911 U/L，α-羥丁酸脫氫酶605 U/L，肌酸激酶2 928 U/L，肌酸激酶同工酶215 U/L；B型鈉尿肽前體36 000 pg/mL；纖維蛋白原80.7 mg/dL；淋巴細胞亞群未見異常；IgG 9.3 g/L，IgA 0.02 g/L，IgM 0.05 g/L；血氨75 μmol/L，乳酸12.0 mmol/L；超敏C 反應(yīng)蛋白12.8 mg/L；血培養(yǎng)人葡萄球菌生長。胸片示心影大，右肺紋理模糊。心臟彩超考慮肥厚型心肌病，右心室及左心室流出道梗阻，冠狀動脈略增寬，卵圓孔未閉，動脈導管未閉。血串聯(lián)質(zhì)譜（不同時間2次）示多種中長鏈?；鈮A增高。尿氣相色譜-質(zhì)譜示4-羥基苯乳酸增高，可能繼發(fā)于肝損傷。入院診斷：新生兒肺炎并呼吸衰竭，心力衰竭，肥厚型心肌病，新生兒敗血癥，高乳酸血癥，多種酰基輔酶A 脫氫酶缺乏癥？患兒入院后予抗感染、呼吸機輔助通氣、抗心力衰竭、降低心率減輕心室流出道梗阻、靜脈營養(yǎng)、補充維生素B2及左卡尼丁等治療后病情逐漸好轉(zhuǎn)，撤離呼吸機后自主呼吸尚可，但復查感染指標反復，升級抗生素后復查感染指標逐漸恢復正常。

因患兒多次血氣分析提示高乳酸血癥，血串聯(lián)質(zhì)譜提示多種?；o酶A脫氫酶缺乏癥可能，在家屬知情同意后行基因檢測。提取患兒及其父母外周血基因組 DNA，使用 Illumina 高通量測序儀和 Agilgent 公司的 SureSelect 探針富集體系進行二代基因測序。使用軟件 CASAVA（1.8.2）將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可識別的堿基序列，然后進行 Align分析、SNP分析和DIP分析，獲得靶向區(qū)域變異位點的信息。通過 PolyPhen-2、SIFT、Mutation Taster 進行蛋白質(zhì)損傷分析，獲得需要進一步驗證的變異位點。在人類基因組數(shù)據(jù)庫GenBank 中獲得 COA 6 基因變異位點基因序列，在引物設(shè)計網(wǎng)站 Primer Z（http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/primerz 4.do）設(shè)計并合成引物。對變異位點進行 PCR 擴增后進行一代測序驗證，排除掉二代測序中假陽性的位點。NGS 測序分析發(fā)現(xiàn)患兒COA6 基因第3外顯子c.411_412insAAAG純合移碼變異（p.Lys140 Arg fs Ter4），從第140個賴氨酸開始的氨基酸合成發(fā)生改變，并在改變后的第 4 個氨基酸終止。c.411_412insAAAG變異可能造成蛋白質(zhì)的功能受到影響，c.411_412insAAAG變異尚未見文獻報道（參考數(shù)據(jù)庫 HGMD Pro及 PubMed）。該變異不歸類為多態(tài)性變化，在人群中的發(fā)生頻率極為低下（參考數(shù)據(jù)庫 1000 Genomes 和dbSNP）。經(jīng)分析未見可疑的 CNV 變異。線粒體基因二代測序檢測未發(fā)現(xiàn)受檢者有臨床意義的線粒體基因變異；MLPA 檢測未發(fā)現(xiàn)受檢者線粒體基因存在大片段變異。家系驗證顯示，父母均為COA 6 基因c.411_412 insAAAG 雜合攜帶者，符合常染色體隱性遺傳規(guī)律（圖 1）。但未發(fā)現(xiàn)ACADVL、ETFA、ETFB 或ETFDH 基因變異。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會(ACMG)聯(lián)合美國分子病理學會(AMP) 2015 年制訂的“基因序列變異解釋的標準和指南”進行致病性分析[1]。COA 6 基因c.411_412 insAAAG 的致病性：①當某基因致病機制為功能缺失（loss-of-function,LOF）時，該基因上的無義變異、移碼變異、±1 或 2 位置的剪切變異、起始密碼子變異、單個或多個外顯子缺失（非常強的致病性證據(jù)，PVS 1）；②c.193 delC 變異通過比對千人基因組數(shù)據(jù)庫（1000 Genomes）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）未見收錄（中等致病性證據(jù)，PM 2）。綜合上述c.411_412 insAAAG 變異的證據(jù)強度為“PVS 1+PM 2”，判斷為造成患兒發(fā)病的疑似致病性變異。

圖1 患兒及父母COA6 基因c.411_412 ins AAAG 變異測序圖

結(jié)合患兒臨床表現(xiàn)、心臟彩超及基因檢測結(jié)果，診斷為COA6基因c.411_412 ins AAAG純合變異所致的CEMCOX4。患兒出院后繼續(xù)口服美托洛爾、維生素B2和左卡尼汀，告知家屬患兒有猝死風險，勿煩躁哭鬧。定期復查乳酸顯示較住院時下降，但仍未恢復至正常范圍，停用維生素B2和左卡尼汀。

2 討論

COA6基因定位于1q42，基因組全長約10.59 kb，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，外顯子長度約710 bp，編碼155 個氨基酸。目前尚無COA6 基因變異以何種變異為最多的報道，也無基因型與表型關(guān)系的報道。

CcO 是呼吸鏈的末端酶且是細胞呼吸的主要部位。CcO 是進化上高度保守的多亞基酶復合體，由酵母中的11 個亞基和哺乳動物中的13 個亞基組成。除了蛋白質(zhì)亞基外，CcO 還包括幾個輔因子，包括2 個Cu 位點（CuA 和CuB），2 個血紅素基團（血紅素a 和a3）和1個鎂和鋅離子。細胞色素c錨定在COX2的膜間隙上，它包含1個雙核銅中心，稱為CuA，接受電子，之后電子被傳遞至COX1中的血紅素基團，再傳遞至血紅素a3-CuB位點，最后傳遞至分子氧，后者被還原成水。CcO 的生物合成過程極其復雜，需要最多達40種不同的組裝因子。Coa6是一種具有CX9C-CX10C序列基序的可溶性膜間隙蛋白，人類細胞中Coa 6 缺失導致COX組裝和活性降低，但這種缺陷可以通過外源性的銅補充來部分挽救[2]。

CcO的組裝缺陷具有臨床異質(zhì)性，可累及機體的1個或多個器官系統(tǒng)，發(fā)病年齡從嬰兒到成年期不等。這些疾?。ň€粒體復合體Ⅳ缺陷）以廣泛的臨床表型為特征，包括心肌病、腦肌病、骨骼肌肌病、Leigh 綜合征、代謝性酸中毒和偶發(fā)肝衰竭。但只有少數(shù)復合體Ⅳ可追蹤到CcO的核心亞基，且大多數(shù)患兒在編碼組裝因子的基因中發(fā)現(xiàn)了變異，其中包括富含亮氨酸的五肽重復序列即motif-containing蛋白LRPPRC——一種線粒體mRNA穩(wěn)定蛋白，TACO1——一種COX1的翻譯激活劑以及人類COX14同源物，C12orf62——一種參與COX 1 合成和組裝的因子；同樣在COX 10和COX 15、血紅素合成所需CcO 組裝因子以及將銅插入CcO 所需的SCO 1 和SCO 2 基因中也發(fā)現(xiàn)了致病性變異。但其他疾病基因，包括SURF1、C2orf64/COA5和FAM36A在CcO組裝中的確切作用尚未完全明確。

有報道1 例男嬰罹患因COA 6 基因復合雜合變異所致的致命性嬰兒心腦肌病，6 月齡時診斷為肥厚型梗阻性心肌病，且有肌肉體積下降和肌張力降低以及進行性無力和嗜睡，18 月齡死于心力衰竭[3-4]。對酵母同源物的研究表明，變異導致Coa 6 的線粒體水平下降，變異蛋白無法補救Coa 6 缺失酵母的線粒體呼吸生長缺陷，與功能喪失一致。Morpholino敲除斑馬魚胚胎COA 6 基因可導致心臟發(fā)育和功能缺陷。

另有報道1例阿拉伯血統(tǒng)罹患因COA6基因變異所致的致命性心腦肌病女嬰，其父母近親婚配；出生時患兒表現(xiàn)為肌張力降低、心前區(qū)收縮期雜音及輕度的畸形特征（面容異常，包括小下巴及眼眶扁平），出生后不久進展為嚴重的乳酸酸中毒、體溫過低和呼吸急促；超聲心動圖顯示影響雙側(cè)心室的嚴重肥厚型心肌病，伴左心室部分區(qū)域致密化不全，二尖瓣、三尖瓣和肺動脈瓣關(guān)閉不全；5 周齡時去世。經(jīng)全外顯子組測序及Sanger驗證，在患兒的COA6基因中發(fā)現(xiàn)純合錯義變異（W66 R）?；純撼衫w維細胞COA6蛋白缺乏和線粒體復合體Ⅳ減少，用銅處理成纖維細胞可使復合體Ⅳ及其亞基的穩(wěn)定性增加，提示可能的治療選擇[5]。

嬰兒CcO缺陷致心腦肌病在遺傳上具有異質(zhì)性，除了染色體 1q42上的COA6基因可造成嬰兒CcO缺陷致心腦肌病4型外，尚有染色體10q24上的COX15基因變異所致的CEMCOX2、染色體 2q11上的COA5基因變異所致的CEMCOX3。

與致死性嬰兒心腦肌病關(guān)聯(lián)密切的基因有SCO2、COX15、COA5和COA6。希臘和美國聯(lián)合報道了3例無血緣關(guān)系的SCO2基因變異引起致死性嬰兒心腦肌病，均表現(xiàn)為肥厚性心肌病、乳酸性酸中毒和膠質(zhì)增生。心臟和骨骼肌活檢顯示COX活性降低，而肝臟和成纖維細胞有輕度COX 缺乏。其中2 例患兒的肌肉組織化學顯示在所有纖維中COX 酶活性均降低，但琥珀酸脫氫酶活性正常，未見碎紅纖維。免疫組織化學顯示線粒體編碼的COX Ⅰ和COXⅡ亞基嚴重減少，而核編碼的COX Ⅳ亞基和COX Ⅴa 存在，但活性下降。由SCO 2 基因變異引起的COX 缺乏癥的臨床表型與其他基因變異引起的臨床表型有所不同。德國報道了來自2 個無血緣關(guān)系家庭的3 例SCO 2 基因變異引起致死性嬰兒心腦肌病患者，他們出生時出現(xiàn)低血壓、呼吸困難、血液和腦脊液乳酸增加、肥厚性心肌病和嚴重COX 活性下降，均在嬰兒期死亡。美國報道了1 名婦女，第1 次懷孕在妊娠11 周自然流產(chǎn)；第2 個孩子于53 天死于致死性嬰兒心腦肌病，該患兒SCO 2 基因有2 個復合雜合變異；第3 次懷孕也在妊娠10周自然流產(chǎn)，流產(chǎn)物基因檢測顯示與第2胎相同SCO 2 基因變異，SCO 2 基因變異可能與早期自然流產(chǎn)有關(guān)。荷蘭也報道2例同胞胎罹患致死性嬰兒心腦肌病，先證者出生時四肢肌張力低下和呼吸功能不全，之后進展為癲癇發(fā)作和吸氣性喘鳴（認為部分原因與腦干異常有關(guān)），出生后第25 天死于肥厚性心肌??；實驗室檢查顯示乳酸和丙酮酸增高，心臟彩超檢查顯示進行性肥厚性心肌病，尸檢顯示心肌細胞胞漿空泡化，腦顯像示與線粒體疾病相符的腦室周圍白質(zhì)、皮質(zhì)脊髓束和胼胝體改變；心臟（正常對照值的1%）、肌肉（19%）和培養(yǎng)的成纖維細胞（16%）COX-Ⅳ活性降低；遺傳學分析確定了SCO 2 基因2個復合雜合變異（E 140 K 和W 36 X）；在其第2 胎妊娠中期進行的羊膜穿刺基因檢測時發(fā)現(xiàn)攜帶了SCO2基因相同的變異，遂于妊娠23周選擇人工流產(chǎn)，流產(chǎn)物尸檢顯示女性胎兒心臟明顯增大和腦回復雜程度降低，提示產(chǎn)前心臟和大腦的異常。有報道1 例出生時持續(xù)性呼吸窘迫需要呼吸支持的小頭畸形女嬰，出生不久即有持續(xù)性乳酸酸中毒腦病，出生第9 天持續(xù)出現(xiàn)腦病，伴運動減弱及呼吸抑制，拔除氣管插管20分鐘后死亡；頭顱MRI顯示細微改變，內(nèi)囊后肢沒有明顯髓鞘形成；心臟彩超顯示所有心肌壁明顯肥大及射血分數(shù)降低；死后骨骼肌活檢顯示復合體Ⅳ活性輕微降低，而心肌中卻發(fā)現(xiàn)明顯的復合體Ⅳ缺乏，其他呼吸鏈復合體活性不顯著；病理組織學顯示心臟雙心室肥大，伴有糖原沉積及COX 染色缺乏，此外骨骼肌肌原纖維間質(zhì)和漿膜下糖原增多，肝臟脂肪變性，腦膠質(zhì)增生；基因測序提示COX 15 基因父源性c.452 C>G 及母源性c.649 C>T 復合雜合變異[6]。另有報道，1對父母為土耳其血統(tǒng)的雙胎兄妹，其CcO缺乏表現(xiàn)為致命性新生兒肥厚性心肌病，分別在出生第8天和第10天死亡；尸檢顯示心肌細胞內(nèi)脂肪滴聚集，線粒體增殖；但2 例患兒均無大腦或骨骼肌損害的記錄；成纖維細胞染色提示復合體Ⅳ活性嚴重下降；基因測序顯示COA5基因純合c.157G>C變異[7]。

上述文獻復習顯示，無論是COA 6 基因，還是SCO2、COX15、COA5基因所致的致死性嬰兒CcO缺陷致心腦肌病臨床多表現(xiàn)為乳酸酸中毒、肌張力低下及肥厚性心肌病，大多預(yù)后極差。本例患兒出生后持續(xù)呼吸困難5 天，檢查提示多次高乳酸血癥和肥厚性心肌病，雖2 次血串聯(lián)質(zhì)譜均提示多種酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥可能，且補充維生素B2及左卡尼汀后乳酸稍有下降，但仍未降至正常范圍，經(jīng)全外顯子及線粒體基因檢測最終診斷為 CEMCOX 4。盡管依據(jù)ACMG和AMP“基因序列變異的解釋標準和指南”進行的致病性分析尚不能確認COA 6 基因c.411_412 insAAAG純和變異位點的致病性，但患兒有較為明顯的CEMCOX4臨床表現(xiàn)，且c.411_412 insAAAG純和變異不屬于多態(tài)性變化，在人群中出現(xiàn)的概率極其低下（參考的數(shù)據(jù)庫為1000 Genomes 及dbSNP），綜合患兒的基因檢測結(jié)果及臨床表型，可基本確認c.411_412 insAAAG 純和變異為患兒的致病性變異。

本研究報告1例CEMCOX4 病例，其COA6 基因c.411_412 ins AAAG純合變異國際上尚未見報道，擴充了CEMCOX4的基因變異譜。