基于氣相指紋圖譜技術(shù)研究鮮白扁豆花、凍干白扁豆花和干白扁豆花的成分*

河北中醫(yī)學(xué)院 河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心

劉興超 彭小園 師新穎 張清清 王紅芳 周 莉 李 斯 李?lèi)?ài)英 (石家莊 050200)

提要 本研究以白扁豆花為原料，首次通過(guò)氣相(GC)色譜指紋圖譜技術(shù)，考察鮮白扁豆花、凍干白扁豆花和曬干白扁豆花成分的差異。色譜柱為DB-1毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，流速為1 mL/min。凍干白扁豆花和鮮白扁豆花的指紋圖譜相似度比值為0.950以上；而曬干白扁豆花和鮮白扁豆花的指紋圖譜相似度比值為0.720左右；采用氣相質(zhì)譜(GC-MS)方法，鮮白扁豆花共計(jì)檢測(cè)出13種成分，鮮白扁豆花、凍干扁豆花和曬干扁豆花中成分的種類(lèi)差異不大，但是相似度數(shù)值有差別，凍干扁豆花可替代鮮扁豆花應(yīng)用于臨床。凍干扁豆花可以更能有效的避免因儲(chǔ)存而導(dǎo)致的有效成分的減少，有利于白扁豆花更好地應(yīng)用于臨床。

白扁豆花是豆科扁豆屬植物扁豆DolichoslablabL.的干燥花，呈扁平不規(guī)則三角形，具有解暑化濕、和中健脾之功效，用于治療痢疾、泄瀉、赤白帶下等癥，在我國(guó)具有悠久的應(yīng)用歷史。經(jīng)典名方“新加香薷飲”中采用的是鮮白扁豆花，而有的則采用的是干扁豆花，兩者內(nèi)在成分的差異可能決定了其藥效的差異。本項(xiàng)研究的目的在于研究鮮白扁豆花、凍干白扁豆花和曬干白扁豆花的成分差異，為凍干扁豆花替代鮮扁豆花提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持，同時(shí)，通過(guò)氣相質(zhì)譜(GC-MS)方法對(duì)鮮白扁豆花的揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，這些揮發(fā)性成分的鑒定，為白扁豆花的藥理和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)支持。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 7890B氣相(GC)色譜儀，Agilent 7890B-7000C GC-MS聯(lián)用儀(配有Mass Hunter質(zhì)譜工作站， NIST 14標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù))，中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版本；甲醇(色譜純)。

1.2 樣品 白扁豆花采自于河北中醫(yī)學(xué)院藥草園，白扁豆種子經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院王乾老師鑒定為DolichoslablabL.的種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的處理

2.1.1 鮮白扁豆花:摘取鮮白扁豆花立即置于-80℃低溫冰箱中，冷凍，而后于液氮中研碎，稱(chēng)取1 g，加入25 mL容量瓶中，加入15 mL甲醇，回流30 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣1 μL 進(jìn)行測(cè)定。

2.1.2 凍干白扁豆花:摘取鮮白扁豆花立即置于-80 ℃低溫冰箱中，而后于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，研碎，稱(chēng)取1 g，加入25 mL容量瓶中，加入15 mL甲醇，回流30 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣1 μL 進(jìn)行測(cè)定。

2.1.3 干白扁豆花:摘取鮮白扁豆花，曬干，研碎，稱(chēng)取1 g，加入25 mL容量瓶中，加入15 mL甲醇，回流30 min，放冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，進(jìn)樣1 μL 進(jìn)行測(cè)定。

2.2 GC色譜條件

2.2.1 GC色譜指紋圖譜條件:DB-1毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：柱初始溫度為80 ℃，以10 ℃ /min的速率升至300 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；載氣：N2；載氣流速：1 mL/min；分流比：20 ∶1。

2.2.2 GC-MS色譜條件:色譜柱、升溫程序同GC色譜指紋圖譜條件；載氣：He；載氣流速：1 mL/min；分流比：100 ∶1。EI離子源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電子能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；質(zhì)量范圍：50～600 m/z。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)研究 主要針對(duì)進(jìn)樣精密度、樣品重復(fù)配制后的重復(fù)性以及樣品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以鮮扁豆花為研究對(duì)象，將所得的圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，通過(guò)各色譜圖之間相似度比值，進(jìn)而確定方法的適用性。本方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性研究相似度均在0.99以上，說(shuō)明方法適用性良好。

3.2 各類(lèi)白扁豆花成分的差異 對(duì)鮮白扁豆花、凍干白扁豆花和干扁豆花的成分進(jìn)行分析，每個(gè)種類(lèi)的樣品分別重復(fù)檢測(cè)3次，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。分析結(jié)果見(jiàn)圖1、表1。

注：S1、S2、S3-鮮白扁豆花；S4、S5、S6-凍干白扁豆花；S7、S8、S9-曬干白扁豆花。

表1 各種扁豆花相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

從圖1的結(jié)果可以看出，鮮白扁豆花、凍干白扁豆花和干白扁豆花種類(lèi)內(nèi)部之間，差異較小，說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性較好；鮮白扁豆花和凍干白扁豆花之間的相似度在0.950以上，說(shuō)明相似度非常接近；鮮白扁豆花和干白扁豆花之間的相似度在0.720左右，有較大的差異。根據(jù)氣相圖譜可以看出，鮮白扁豆花、凍干白扁豆花和干扁豆花之間成分的種類(lèi)并無(wú)顯著的差異，僅是成分的含量差異較大。從提取溶液的顏色來(lái)看，鮮白扁豆花和凍干白扁豆花為綠黃色，而干白扁豆花為淺黃色。

3.3 鮮白扁豆花揮發(fā)性成分 本項(xiàng)研究對(duì)鮮白扁豆花進(jìn)行GC-MS分析，得到揮發(fā)性成分的總離子流圖(見(jiàn)圖2)。采用NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索結(jié)合文獻(xiàn)資料，對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行定性鑒別，根據(jù)正反匹配率≥800，共得到13種成分，成分鑒定結(jié)果詳見(jiàn)表2。

圖2 GC-MS總離子流圖

表2 鮮白扁豆花揮發(fā)性成分

從表2可以看出，通過(guò)GC-MS方法檢測(cè)出白扁豆花揮發(fā)性成分13種，其主要成分是脂肪酸及其酯，其中含量最高的是棕櫚酸，是一種飽和高級(jí)脂肪酸，具有降血清中膽固醇和促進(jìn)骨折愈合的作用[1]，還可以誘導(dǎo)L6細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗[2]和抑制肝星狀細(xì)胞增殖[3]。月桂酸有較強(qiáng)的抗菌活性，其可通過(guò)破壞細(xì)胞壁，干擾細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮殺菌作用，且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[4]。而肉豆蔻酸具有很好的抗菌作用，常用于治療寒痢、腹脹、腹痛及消化不良等癥狀[5]。棕櫚酸甲酯則是生物柴油、化妝品和植物殺螨劑的原料[6]，同時(shí)也是具有抗結(jié)核和抗纖維前景的藥物。肉豆蔻油酸具有潛在的控制體質(zhì)量，預(yù)防二型糖尿病、心血管病、酒精性脂肪肝和抗炎等作用。

3.4 提取條件的考察 GC法測(cè)定白扁豆花中揮發(fā)性成分時(shí)，考察了超聲提取、回流提取和索式提取3種方法，根據(jù)GC指紋圖譜的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)回流提取的揮發(fā)性成分涵蓋超聲提取和索式提取的產(chǎn)物，故上述結(jié)果中，僅列出了回流提取的結(jié)果。

4 結(jié)論

首次通過(guò)GC色譜指紋圖譜技術(shù)比較鮮白扁豆花、凍干白扁豆花和曬干白扁豆花成分的差異，鮮扁豆花，凍干扁豆花和曬干扁豆花中成分的種類(lèi)差異不大，但是，鮮白扁豆花和凍干白扁豆花之間的相似度在0.950以上，說(shuō)明相似度非常接近；鮮白扁豆花和干白扁豆花之間的相似度在0.720左右，具有較大的差異，其中鮮扁豆花成分中含有甘露醇、野漆樹(shù)苷、草木犀素-7-O葡萄糖苷等成分，會(huì)因儲(chǔ)藏環(huán)境和方法不當(dāng)而導(dǎo)致其質(zhì)量降低，減弱或改變其藥效[7]。使用質(zhì)量較低的中藥飲片對(duì)患者進(jìn)行治療可導(dǎo)致其發(fā)生多種用藥不良反應(yīng)，威脅其健康和生命安全[8-9]。因而某些經(jīng)典名方中特意標(biāo)注應(yīng)用鮮白扁豆花，而不是干白扁豆花。而凍干扁豆花則可以減少成分變性和失活，保留藥材的活性成分，而且攜帶方便。綜上所述，若考慮鮮白扁豆花的長(zhǎng)久使用性、有效性、便利性，可采用凍干白扁豆花，也使得白扁豆花更好的應(yīng)用于臨床，提高臨床療效。同時(shí)本研究采用了GC-MS方法，鮮白扁豆花共計(jì)檢測(cè)出13種成分，這些揮發(fā)性成分為白扁豆花的藥理和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，也為后續(xù)的綜合利用提供更充分的理論依據(jù)。