一株用于菌糠發(fā)酵的木霉菌株的篩選及其培養(yǎng)工藝

鐘麗娟 趙新海

摘要：以污染香菇菌棒和黑木耳菌棒的木霉為來(lái)源，篩選到一株適用于菌糠發(fā)酵的木霉菌株X-05，對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株X-05對(duì)番茄灰霉病病菌和黃瓜枯萎病病菌均具有較好的抑菌效果。以廢棄香菇菌糠、黑木耳菌糠作為培養(yǎng)基質(zhì)，測(cè)定外源氮源、水分及pH值對(duì)木霉菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響，結(jié)果表明，香菇菌糠、黑木耳菌糠均適合木霉生長(zhǎng)，在尿素添加量為3%、料液比為1 g ∶ 2.5 mL、初始pH值為4.5～5.0的條件下，于30 ℃培養(yǎng)7 d后香菇菌糠、黑木耳菌糠的產(chǎn)孢量可達(dá)3.67×109～7.00×109 CFU/g。

關(guān)鍵詞：香菇;黑木耳;菌糠;綠木霉;pH值

菌糠是指食用菌菌棒采收后廢棄的固體培養(yǎng)料，其成分主要為尚未被完全利用的纖維素、木質(zhì)素、粗脂肪和食用菌菌絲體等。目前，食用菌產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)第六大種植產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)量已超過(guò)3 000萬(wàn)t，同時(shí)產(chǎn)生了大量廢棄菌糠。近年來(lái)，研究人員針對(duì)菌糠的綜合利用開(kāi)展了大量研究，主要集中在將其用作畜禽飼料、有機(jī)肥料、蔬菜基質(zhì)、生物質(zhì)顆粒、食用菌培養(yǎng)料等方面[1-3]，積極推動(dòng)了食用菌產(chǎn)業(yè)鏈條的延長(zhǎng)。此外，生物防治土傳病害的潛力和效果越來(lái)越得到重視，其中利用木霉菌防治作物各類(lèi)病害的效果及其作用機(jī)制已有大量相關(guān)報(bào)道，美國(guó)、以色列、中國(guó)、印度、瑞典等多個(gè)國(guó)家已經(jīng)實(shí)現(xiàn)木霉制劑的商品化應(yīng)用[4-6]。但在實(shí)際生產(chǎn)中，生物防治常存在使用成本高、見(jiàn)效慢、產(chǎn)品貨架期短等問(wèn)題，其中見(jiàn)效慢是由生物防治與化學(xué)防治的作用機(jī)制不同造成的，而使用成本高、產(chǎn)品貨架期短歸根結(jié)底其實(shí)是由生防菌劑生產(chǎn)成本高、菌株抗逆性和定植能力差等導(dǎo)致的[7-8]。開(kāi)展利用廢棄菌糠培養(yǎng)木霉的研究，一方面可以解決木霉等生防菌定植難的問(wèn)題，另一方面可有效資源化利用廢棄菌糠，對(duì)于推廣植物病害的生物防治和農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化循環(huán)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

木霉菌株來(lái)源于喀左縣尤杖子鄉(xiāng)香菇種植基地的香菇染菌棒和喀左縣大營(yíng)子鄉(xiāng)黑木耳種植基地的黑木耳染菌棒。

番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea）、黃瓜枯萎病病菌（Fusarium oxysporum）由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院吳元華教授饋贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方：200.0 g馬鈴薯（去皮），20.0 g葡萄糖，1.5 g MgSO4·7H2O，3.0 g KH2PO4，18.0 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH值為6.0。菌糠培養(yǎng)基配方：取粉碎后過(guò)60目篩的香菇菌糠細(xì)粉100.0 g，加入1 000 mL蒸餾水煮沸15 min，再加入瓊脂20.0 g至完全溶化，定容至1 000 mL后，分裝到500 mL三角瓶中。馬丁氏培養(yǎng)基配方：5.0 g蛋白胨，10.0 g葡萄糖，1.0 g KH2PO4，0.5 g MgSO4·7H2O，20.0 g瓊脂，1 000 mL 蒸餾水，pH值自然。每1 000 mL培養(yǎng)基中加3.3 mL 1%孟加拉紅水溶液。臨用時(shí)在每 100 mL 培養(yǎng)基中加0.3 mL 1%鏈霉素溶液。上述培養(yǎng)基于121 ℃滅菌30 min，冷卻后備用。

1.3 原料來(lái)源

黑木耳菌糠取自遼寧省朝陽(yáng)市喀左縣大營(yíng)子鄉(xiāng)大營(yíng)子村黑木耳種植基地，培養(yǎng)基配方如下：78%木屑、19%麩皮、1%石灰、1%石膏，出耳5潮后，自然風(fēng)干、粉碎并混合均勻備用，經(jīng)測(cè)定，pH值為569。香菇菌糠取自遼寧省朝陽(yáng)市喀左縣尤杖子鄉(xiāng)后鋼溝村香菇種植基地，培養(yǎng)基配方如下：78%木屑、19%麩皮、1%石灰、1%石膏，出菇5潮后，自然風(fēng)干、粉碎并混合均勻備用，經(jīng)測(cè)定，pH值為4.83。

1.4 菌株分離

在無(wú)菌條件下用剪刀將染菌棒剪開(kāi)，用接種針挑取木霉產(chǎn)孢濃密部位的培養(yǎng)料，接種至事先倒好的綜合PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品設(shè)5次重復(fù)。將接種后的培養(yǎng)皿于28 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行鏡檢，挑取目的菌落邊緣的菌絲，接種至綜合PDA平皿中央進(jìn)行純化，根據(jù)菌落來(lái)源進(jìn)行編號(hào)，純化2～3次后，分別將菌種轉(zhuǎn)接至斜面綜合PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)至斜面長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲后，于4 ℃冰箱保存。

1.5 菌株篩選

1.5.1 菌株的初篩 挑取冰箱中保藏的、大小約為0.5 cm×0.5 cm的各菌株組織塊，接種至綜合PDA平板培養(yǎng)基中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，分別用6.0 mm打孔器打取菌落邊緣菌絲，將菌苔分別接種至事先倒好的含有菌糠培養(yǎng)基的平皿中央，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察菌落的生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)72 h后，用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測(cè)定木霉菌落的直徑，挑選出3株在菌糠培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的木霉菌株并標(biāo)記清楚，培養(yǎng)120 h后分別用20 mL無(wú)菌水洗滌平板上的木霉孢子，制成孢子懸浮液，適當(dāng)稀釋后采用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子數(shù)量[9]。

1.5.2 菌株復(fù)篩 分別將初篩得到的3株木霉、番茄灰霉病病菌和黃瓜枯萎病病菌接種至事先倒好的綜合PDA平皿中央，于28 ℃培養(yǎng)72 h（黃瓜枯萎病病菌需培養(yǎng)120 h）后，用6.0 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌落，將木霉接種至綜合PDA平皿中央，番茄灰霉病病菌或黃瓜枯萎病病菌按等邊三角形接種3點(diǎn)，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)進(jìn)行抑菌效果的測(cè)定。待木霉菌絲與病原菌菌絲接觸后，用游標(biāo)卡尺測(cè)定木霉和病原菌的菌落半徑。通過(guò)初篩、復(fù)篩，確定1株木霉作為菌糠發(fā)酵用木霉菌株。

1.6 菌株鑒定

將復(fù)篩獲得的木霉接種至綜合PDA培養(yǎng)基上，用于觀察菌落形態(tài)。另取平板，距離接種點(diǎn)約 2 cm，用滅菌鑷子各斜插入4片滅菌蓋玻片，用于觀察菌絲、孢子等顯微形態(tài)。將平板于28 ℃培養(yǎng)，定期觀察菌落生長(zhǎng)情況，及時(shí)進(jìn)行分生孢子梗、分生孢子及菌絲的顯微觀察。

真菌的形態(tài)學(xué)鑒定參照魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》[10]和Gams、Bissett的分類(lèi)系統(tǒng)檢索表[11]。

1.7 菌株生物學(xué)特性測(cè)定方法

1.7.1 溫度試驗(yàn) 設(shè)置15、20、25、30、35、40 ℃等6個(gè)溫度處理，培養(yǎng)基為綜合PDA。

1.7.2 pH值試驗(yàn) 用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH分別將綜合PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8，制成不同pH值的培養(yǎng)基。將4 ℃冰箱保藏的菌株轉(zhuǎn)接至綜合PDA平板上，培養(yǎng)48 h備用。用直徑為6 mm的打孔器將準(zhǔn)備好的菌落平板制備成菌苔。將各培養(yǎng)基制備成平板并做好標(biāo)記，用移植針將菌苔轉(zhuǎn)接至平板中央，在進(jìn)行溫度試驗(yàn)時(shí)，分別將各處理放入15、20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)箱中，在進(jìn)行其他處理時(shí)，將平板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行倒置培養(yǎng)。定期觀察并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量，采用十字交叉法測(cè)定菌落的直徑。

1.8 菌株產(chǎn)孢培養(yǎng)工藝的研究

在菌株生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)上，以香菇菌糠、黑木耳菌糠為主要培養(yǎng)基質(zhì)，以木霉分生孢子產(chǎn)生量作為檢測(cè)指標(biāo)，測(cè)定外源氮、水分及pH值對(duì)木霉菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中結(jié)合生產(chǎn)的可操作性，作如下設(shè)計(jì)：（1）料水比試驗(yàn)。A1處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 1.5 mL;A2處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 2 mL;A3處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 2.5 mL;A4處理添加100%香菇菌糠，料液比為1 g ∶ 3.0 mL。（2）pH值試驗(yàn)。B1處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.0，料液比為1 g ∶ 2.5 mL;B2處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，料液比為1 g ∶ 2.5 mL;B3處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.0，料液比為1 g ∶ 2.5 mL，B4處理添加100%香菇菌糠，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0，料液比為 1 g ∶ 2.5 mL。（3）氮源試驗(yàn)。C1處理添加97%香菇菌糠、3%尿素，pH值自然;C2處理添加97%香菇菌糠、3%硫酸銨，pH值自然;C3處理添加97%香菇菌糠、3%磷酸銨，pH值自然。（4）黑木耳菌糠試驗(yàn)。D1處理添加100%黑木耳菌糠，pH值自然;D2處理添加100%黑木耳菌糠，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5;D3處理添加97%黑木耳菌糠、3%尿素，pH值自然。

將上述各處理三角瓶于30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，定期觀察菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢情況，培養(yǎng)7 d時(shí)將物料取出，自然風(fēng)干后備用。采用奧立龍STAR-A211測(cè)定各培養(yǎng)料初始pH值及風(fēng)干樣品10倍液的pH值，并在馬丁氏培養(yǎng)基上采用稀釋涂平板法測(cè)定各樣品的分生孢子數(shù)，在進(jìn)行樣品稀釋時(shí)，用滅菌擦鏡紙過(guò)濾孢子懸浮液以除去木霉菌菌絲。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與篩選結(jié)果

木霉感染食用菌菌棒后期會(huì)產(chǎn)生大量綠色分生孢子，較容易鑒別，從12棒香菇染菌棒、5棒黑木耳染菌棒上共分離到19株木霉，以香菇菌糠作為唯一營(yíng)養(yǎng)源，測(cè)定各菌株在含10%香菇菌糠平板上的生長(zhǎng)速度。由表1可知，木霉菌菌株在香菇菌糠培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度存在差異，但均可良好生長(zhǎng);相比較而言，菌株X-05、X-08、M-03的生長(zhǎng)速度較快。采用血球計(jì)數(shù)板鏡檢法對(duì)3株木霉的產(chǎn)孢能力進(jìn)行初步測(cè)定，由表2可以看出，3株木霉均具有較強(qiáng)的產(chǎn)孢能力，28 ℃培養(yǎng)120 h時(shí)，產(chǎn)孢量可達(dá)109～1010CFU/皿。

由表3、圖1和圖2可以看出，3株木霉對(duì)供試2株病原菌均具有較好的重寄生作用， 接種 2 d 后木霉菌與病原菌菌絲接觸，隨后病原菌受木霉拮抗而停止生長(zhǎng)，木霉繼續(xù)向病原菌菌落上生長(zhǎng)、產(chǎn)孢，最后覆蓋整個(gè)菌落。通過(guò)比較可以看出，菌株X-05對(duì)供試2株病原菌的拮抗效果最好，與其對(duì)峙培養(yǎng)的病菌菌落直徑小，并且產(chǎn)孢略早。

2.2 菌株X-05的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

菌株X-05在綜合PDA平板上生長(zhǎng)較快，在生長(zhǎng)初期菌落為白色，培養(yǎng)72 h后開(kāi)始變稀疏并產(chǎn)孢，后期因產(chǎn)生大量分生孢子而使菌落呈深綠色，產(chǎn)孢后常出現(xiàn)同心輪紋狀。菌落背面初期無(wú)色，后期略呈淺黃色。菌絲透明，直徑為1.8～3.2 μm，有隔，細(xì)胞壁光滑，分生孢子梗由菌絲直立生出，無(wú)色，分支多，對(duì)生或互生2～3級(jí)分支;分支與分生孢子梗間近似呈直角，末端為小梗，小梗呈瓶形，頂部縊縮，分生孢子無(wú)色，球形或橢圓形，大小為（2.2～2.9） μm×（2.4～3.5） μm，分生孢子常在孢子梗頂端聚集成團(tuán)狀（圖3）。參照魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》和Gams、Bissett的分類(lèi)系統(tǒng)檢索表，鑒定菌株X-05為綠木霉（Trichoderma viride Pers.ex Fr.）。

2.3 菌株的生物學(xué)特性研究

2.2.1 溫度對(duì)菌株X-05菌絲生長(zhǎng)的影響 由表4可以看出，菌株X-05在15～40 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，溫度對(duì)其生長(zhǎng)的影響顯著，最適生長(zhǎng)溫度范圍為25～30 ℃;當(dāng)溫度低于20 ℃時(shí)或高于35 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)緩慢。

2.2.2 pH值對(duì)菌株X-05菌絲生長(zhǎng)的影響 結(jié)合菌糠初始pH值及生產(chǎn)上的可操作性，測(cè)定pH值為3～8對(duì)菌株X-05菌絲生長(zhǎng)的影響。由表5可以看出，菌株X-05菌絲在供試pH值條件下均生長(zhǎng)良好，其中酸性環(huán)境更適于木霉菌菌絲的生長(zhǎng)與產(chǎn)孢，最適pH值為4～5。

2.4 菌株X-05產(chǎn)孢培養(yǎng)工藝研究

以香菇菌糠、黑木耳菌糠作為培養(yǎng)基質(zhì)，研究料液比、外加氮源及pH值對(duì)木霉菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響。由表6可以看出，當(dāng)料液比為1 g ∶ 2.5 mL時(shí)，培養(yǎng)料含水量適宜，表層不易失水，三角瓶底部無(wú)積水，木霉菌絲生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)料的產(chǎn)孢量更大，原因可能是培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)，料液比過(guò)低易導(dǎo)致表層失水干燥，而含水量過(guò)高易造成瓶底積水，出現(xiàn)染菌。外加氮源對(duì)木霉菌菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其中添加尿素、硫酸銨的效果明顯優(yōu)于添加磷酸銨的效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，初始pH值對(duì)木霉菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢具有明顯影響，當(dāng)培養(yǎng)料的初始pH值為 4.0～5.0時(shí)，木霉菌菌絲生長(zhǎng)更旺盛，產(chǎn)孢時(shí)間早，產(chǎn)孢量大。

3 結(jié)論與討論

木霉是食用菌生產(chǎn)中比較常見(jiàn)的雜菌，嚴(yán)重危害了食用菌生產(chǎn)。從另一個(gè)角度看，木霉是生物防治土傳病害的主力軍，特別是對(duì)于設(shè)施蔬菜生產(chǎn)而言，常年大量使用化肥農(nóng)藥而導(dǎo)致的不良后果已經(jīng)受到人們的關(guān)注，生物防治理念及其相關(guān)產(chǎn)品的推廣應(yīng)用將成為熱點(diǎn)。在實(shí)際生產(chǎn)中，有機(jī)肥的銷(xiāo)售半徑受限，受經(jīng)濟(jì)收益的限制，很多菌糠利用技術(shù)尚未得到有效應(yīng)用，因此在菌糠利用時(shí)，應(yīng)盡可能考慮就近消化利用。針對(duì)縣域種植業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和食用菌產(chǎn)業(yè)的特點(diǎn)，擬探索適合區(qū)域應(yīng)用的菌糠利用模式，構(gòu)建農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)經(jīng)濟(jì)模式?？ψ罂h的食用菌產(chǎn)業(yè)以香菇和黑木耳為主，設(shè)施蔬菜生產(chǎn)以黃瓜、辣椒、茄子、番茄等為主。近年來(lái)，隨著種植年限的延長(zhǎng)，土傳病害問(wèn)題日益凸顯，本研究以喀左縣主栽食用菌香菇、黑木耳菌糠為基礎(chǔ)，篩選得到一株既可以在菌糠上良好產(chǎn)孢又兼具生防效果的木霉菌株。模擬培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，菌糠粉碎后，在尿素添加量為3%、料液比為1 g ∶ 2.5 mL、初始pH值為4.5～5.0、30 ℃條件下培養(yǎng)7 d，產(chǎn)孢量可達(dá)3.67×109～7.00×109 CFU/g，符合農(nóng)用微生物制劑菌數(shù)高于0.5億/g的產(chǎn)品要求，具有較好的應(yīng)用前景。但應(yīng)注意的是，香菇、黑木耳菌糠及木霉培養(yǎng)物的pH值均為酸性，直接施用于土壤存在使土壤酸化的風(fēng)險(xiǎn)，其使用方法及施用量還需要深入研究。

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