CMA聯(lián)合染色體核型分析對(duì)胎兒結(jié)構(gòu)異常的篩檢效力影響

謝倩倩,田瑞霞,姚榮華,高 靜,吳雋姝,吳明星,趙旭亮△

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230001； 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230001)

產(chǎn)前超聲檢查可發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常胎兒，從而分析胎兒是否有先天性遺傳疾病。在經(jīng)超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常后，利用常規(guī)染色體核型分析，可進(jìn)一步對(duì)胎兒染色體結(jié)構(gòu)、數(shù)目異常情況進(jìn)行分析[1]。但其也有較明顯缺點(diǎn)，如存在培養(yǎng)失敗率、操作要求高、結(jié)果易受多種因素影響、耗時(shí)長(zhǎng)[2]。并且若胎兒染色體組中存在小片段的染色體缺失則可能無(wú)法檢出。因此為提高染色體異常檢出的準(zhǔn)確性，染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其具有能檢出染色體組微小缺失或重復(fù)片段的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)能對(duì)胎兒全基因組進(jìn)行掃描，實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)染色組的全局分析[3]。但有研究表示，CMA技術(shù)對(duì)染色體倒位、低水平嵌合體的檢出具有局限性[4]?？紤]可將傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)與CMA技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)構(gòu)異常胎兒的染色體分析中，以提高臨床染色體異常檢出率。本研究探討CMA技術(shù)與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胎兒結(jié)構(gòu)異常的篩檢效力。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年6月至2019年10月于中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前超聲診斷后提示胎兒結(jié)構(gòu)異常、有不良妊娠史或孕前夫妻雙方常規(guī)顯帶核型分析顯示有一方有染色體異常的孕婦131例為研究對(duì)象，年齡24～48歲，平均(28.78±2.65)歲，平均孕周(20.25±3.42)周。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)全國(guó)超聲醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的產(chǎn)前超聲胎兒結(jié)構(gòu)異常診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，或有流產(chǎn)、畸形兒生育史等不良妊娠史，或夫妻雙方有一方有染色體異常；(2)年齡大于18歲；(3)孕周11～25周。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)家屬或孕婦不同意參與本研究；(2)超聲顯示致死性結(jié)構(gòu)異常；(3)有羊腹腔穿刺禁忌證。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20180075S03)，孕婦及家屬知情同意。按照檢查方式不同分為CMA組、染色體核型分析組及聯(lián)合組。

1.2 方法

CMA組僅采用CMA技術(shù)分析染色體異常，染色體核型分析組僅采用染色體核型技術(shù)分析染色體異常，聯(lián)合組采用兩種方式聯(lián)合分析染色體異常。所有孕婦入組后均接受超聲檢查，得到產(chǎn)前診斷指征，然后接受CMA、染色體核型分析檢測(cè)。CMA技術(shù)具體方法：(1)由同一級(jí)別婦產(chǎn)科醫(yī)師采用羊腹腔穿刺技術(shù)或臍靜脈穿刺技術(shù)，在B超引導(dǎo)下穿刺抽取羊水，為避免孕婦有創(chuàng)穿刺抽取多次羊水，≤24周的孕婦均在首次抽取羊水時(shí)共抽取30 mL，10 mL進(jìn)行CMA檢查，20 mL進(jìn)行染色體核型分析，>24周的孕婦在首次抽取時(shí)共抽取10 mL羊水、1 mL臍血；(2)采用DNA提取劑(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)D1800)提取羊水基因組DNA；(3)參考Infinium公司的Infinium基因芯片檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)流程操作，將已處理為短片段的DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增片段后對(duì)其進(jìn)行純化，再利用片段化酶將其進(jìn)行短片段化，并進(jìn)行生物素標(biāo)記；(4)將被標(biāo)記物與雜交液混合變性，加載于750 k芯片上，進(jìn)行雜交、掃描、分析。參照已存在的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)結(jié)果判讀。芯片、雜交試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司。CNVs是指大于1 kb的染色體變異。CMA結(jié)果判讀參照DECIPHER、Clinvar、OMIM、DGV、UCSC、ClinGen等數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)果判定為3類(lèi)：致病性CNVs(即確診染色體異常)、良性CNVs及臨床意義不明CNVs[6]。結(jié)果判定為致病性CNVs與臨床意義不明CNVs胎兒父母雙方血液進(jìn)行CMA檢測(cè)，用以確切對(duì)比CNVs性質(zhì)及對(duì)臨床意義不明CNVs進(jìn)行明確，避免造成不必要的妊娠終止。

染色體核型分析方法：不同孕周孕婦抽取羊水、臍血方法與上述相同。將抽取的羊水或臍血轉(zhuǎn)入無(wú)菌管中，離心后棄上清液，收集羊水或臍血細(xì)胞，于培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～10 d后，觀察到細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好時(shí)將細(xì)胞以G帶染色制成染色片，采用高通量全自動(dòng)染色體核型掃描系統(tǒng)(Gene Company Limited，型號(hào)GSL-120)分析染色體核型，每例計(jì)數(shù)40個(gè)分裂象，若觀察到異常核型則增加到至少50個(gè)[7]。分析核型異常種類(lèi)，包括嵌合體、非整倍體(21三體、18三體、13三體)等。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察不同檢查方式的染色體異常情況，以及不同超聲診斷指征的CMA組和染色體核型分析組染色體異常情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同檢查方式的染色體異常情況

單項(xiàng)CMA顯示，22.14%(29/131)致病性CNVs，62.60%(82/131)良性CNVs，15.27%(20/131)臨床意義不明CNVs。單項(xiàng)染色體核型分析顯示，80.15%(105/131)染色體正常，19.85%(26/131)染色體異常，其中19例染色體非整倍體異常(21三體7例，18三體6例，13三體4例，47XXX 2例)、3例嵌合體異常、3例染色體不平衡易位、1例平衡易位。聯(lián)合組檢出的總?cè)旧w異常率23.66%(31/131)，其中染色體核型分析結(jié)果顯示染色體正常的105例胎兒，有5例由CMA技術(shù)檢測(cè)出CNVs>326.4 kb，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，均為致病性CNVs，1p21.3微缺失/微重復(fù)綜合征1例，1q44微缺失/微重復(fù)綜合征1例，4q25微缺失/微重復(fù)綜合征1例，13q12.11微缺失/微重復(fù)綜合征1例，16p11.2微缺失/微重復(fù)綜合征1例。聯(lián)合組檢出的總?cè)旧w異常率最高，但3組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單項(xiàng)CMA檢查與單項(xiàng)染色體核型分析相比，檢測(cè)出了除1例平衡易位、1例低水平嵌合體之外的所有染色體異常胎兒，并且檢出了5例單項(xiàng)染色體核型分析顯示染色體正常胎兒的致病性CNVs。

2.2 不同超聲診斷指征的不同檢查方式染色體異常情況

不同超聲診斷指征胎兒CMA與染色體核型分析陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同超聲診斷指征的不同檢查方式染色體異常情況(n)

3 討 論

產(chǎn)前檢查中超聲診斷是發(fā)現(xiàn)胎兒異常、畸形的有效方式[8]。超聲初步發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常后，需進(jìn)行染色體結(jié)構(gòu)數(shù)目異常分析。而染色體核型分析屬傳統(tǒng)的臨床染色體異常分析方法，能根據(jù)染色體長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)位置等特征，結(jié)合顯帶技術(shù)，對(duì)染色體結(jié)構(gòu)、數(shù)目變異進(jìn)行直接檢測(cè)，識(shí)別斷裂、重復(fù)、缺失、易位、倒位等異常染色體[9]。但染色體核型分析需對(duì)羊水或臍血細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后才能進(jìn)行核型分析，可能存在培養(yǎng)失敗的情況，且細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)人力，不利于提高檢出率[10]。

CMA技術(shù)是一種可在全基因組水平上對(duì)CNVs片段進(jìn)行篩查，對(duì)微小缺失、重復(fù)染色體有明顯檢出優(yōu)勢(shì)的染色體異常分析法[6]。它在檢出不同大小的CNVs后，通過(guò)與人類(lèi)已知基因組庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，可得到致病性CNVs、良性CNVs及意義不明CNVs[11]。并且隨著人類(lèi)基因組庫(kù)的不斷更新，CMA技術(shù)能檢出的致病性CNVs越來(lái)越多，在產(chǎn)前胎兒結(jié)構(gòu)異常的分析中受到臨床青睞[12]。袁暉等[13]研究顯示CMA技術(shù)在胎兒側(cè)腦室增寬中的致病性CNVs檢出率高于傳統(tǒng)染色體核型分析。杜柳等[14]研究也顯示CMA技術(shù)在頸部透明層增厚胎兒中的致病性CNVs檢出率較高，且在染色體核型分析顯示染色體正常的胎兒中額外檢出了致病性CNVs。雖然CMA技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)染色體核型分析方法，但其仍存在個(gè)別異常染色體無(wú)法檢出情況。因此將CMA技術(shù)與傳統(tǒng)染色體核型分析相結(jié)合，可能會(huì)提高胎兒染色體異常檢出率。

本研究顯示，聯(lián)合組總檢出31例(23.66%)染色體異常胎兒，其中26例(19.85%)染色體核型分析組也全部檢出，有29例(22.14%)CMA組也全部檢出。這表示無(wú)論是何種單項(xiàng)檢測(cè)方式，均能檢出大部分染色體異常胎兒，聯(lián)合檢測(cè)率更高。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，采用CMA技術(shù)相對(duì)于單項(xiàng)染色體核型分析而言的額外染色體異常檢出率為4.76%，且這部分額外檢出率是在染色體核型分析為染色體正常胎兒中發(fā)現(xiàn)的，并且CMA技術(shù)有可檢測(cè)染色體異常位點(diǎn)的特點(diǎn)。但CMA技術(shù)未能檢出在染色體核型分析中檢出的1例平衡易位、1例低水平嵌合體染色體異常胎兒，這與吳莉等[15]研究顯示的單項(xiàng)CMA無(wú)法對(duì)平衡易位的染色體進(jìn)行檢測(cè)具有一致性。證實(shí)CMA技術(shù)雖然能提高染色體異常檢出率，但仍無(wú)法完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)染色體核型分析，將兩種檢測(cè)方法結(jié)合是更有利于全面分析胎兒染色體是否異常的有效方式，既彌補(bǔ)了傳統(tǒng)染色體核型分析無(wú)法檢測(cè)微小缺失/重復(fù)片段的缺點(diǎn)，同時(shí)降低CMA技術(shù)對(duì)平衡易位、低水平嵌合體的漏檢率。

先天性心臟病患兒在胎兒期的超聲檢查中通常都能發(fā)現(xiàn)心血管畸形，發(fā)現(xiàn)異常后及時(shí)行產(chǎn)前診斷可以查明病因，為臨床醫(yī)生選擇合適的處理方式提供依據(jù)。本研究中超聲檢出心臟畸形和心內(nèi)膜墊缺失及先天性心臟病和主動(dòng)脈狹窄的異常。除了心臟畸形，染色體異常胎兒的畸形還常常與神經(jīng)系統(tǒng)畸形、四肢畸關(guān)聯(lián)更為緊密，不同類(lèi)型染色體異常有特定的畸形譜，產(chǎn)前超聲可以了解胎兒形態(tài)及結(jié)構(gòu)異常，比如唐氏綜合征或先天愚型畸形主要表現(xiàn)為NT增厚，腦積水、脈絡(luò)叢囊腫，骨骼畸形及消化系統(tǒng)畸形等，部分患兒存在鼻骨缺如等。本次研究中也通過(guò)超聲檢測(cè)出了腦及神經(jīng)系統(tǒng)畸形，泌尿、消化系統(tǒng)畸形，以及骨骼系統(tǒng)等，且與染色體異常重疊，但是本研究顯示不同超聲診斷指征胎兒CMA與染色體核型分析陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，CMA技術(shù)聯(lián)合傳統(tǒng)染色體核型分析的染色體異常檢出率更高，能同時(shí)對(duì)微小缺失/重復(fù)綜合征、平衡易位、低水平嵌合體進(jìn)行檢測(cè)，提高整體染色體異常檢出率，從而為臨床對(duì)染色體異常胎兒是否引產(chǎn)提供更有效的參考價(jià)值。但本研究納入樣本量有限，未能在不同種類(lèi)超聲診斷指征中觀察到采用不同檢測(cè)方式的明顯差異，后續(xù)可通過(guò)對(duì)某幾項(xiàng)超聲診斷指征發(fā)生率較高類(lèi)型進(jìn)行詳細(xì)探究，探究不同檢測(cè)方式在不同超聲診斷指征中的應(yīng)用價(jià)值。