CARD?FISH技術在根系微生物中的研究進展

陳淋霞，張 萌，石佳佳，包智華

（內蒙古大學生態(tài)與環(huán)境學院，呼和浩特010021）

根系是植物與其所在土壤中的微生物相互作用的場所，它為微生物營造了不同的微生境：根際（rhizo?sphere）、根 表 面（rhizoplane）和 內 根 際（endorhizo?sphere）［1?2］。根系微生物可以通過抑制疾病或促進養(yǎng)分吸收對植物的生產(chǎn)力產(chǎn)生積極影響，這在人工和自然生境中都具有重要意義［2?5］。

盡管技術的開發(fā)取得了巨大進展，但是找到合適的方式研究植物根系微生物群落與生境的動態(tài)相互作用仍是一個巨大挑戰(zhàn)。近年來，生物測序技術如高通量和宏組學技術（包括宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學、代謝組學）已廣泛用于環(huán)境微生物領域［4?5］，同位素分析技術追蹤營養(yǎng)物質或污染物的相互轉化過程也是近年研究根系的方式之一。然而，復雜環(huán)境中微生物的作用仍然難以理解，多種因素阻礙了對植物?微生物相互作用的分析，包括功能冗余、瞬時代謝產(chǎn)物、未知功能蛋白質以及基因組潛力和實際功能之間的明顯差距。CARD?FISH 是利用辣根過氧化氫酶（Horse reddish peroxidase，HRP）相連的外源核酸探針與細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，再將熒光連接在有探針結合的細胞蛋白質上，這樣一個探針能將多數(shù)熒光分子沉積在細胞內達到放大信號的作用，再通過熒光顯微鏡將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來的技術；其能精確定位植物組織中特定菌群并完整再現(xiàn)細胞景象信息，為研究根系微生物的復雜機制創(chuàng)造了機會［6?7］。因此，越來越多的研究者選擇CARD?FISH 與其他技術相結合的方法，對植物根系中活性微生物的豐度、多樣性、群落結構、功能代謝及環(huán)境響應能力進行研究［8?9］。本課題組已利用CARD-FISH 對植物組織內生甲烷氧化菌進行研究［9?12］。討論CARD?FISH 的原理、步驟、研究進展以及根系研究的常用方法，重點是CARD?FISH 及其聯(lián)用技術，強調應用組合方法對解開根圈微生物過程的必要性。

1 CARD?FISH原理

熒光原位雜交技術（Fluorescent in situ hybridiza?tion，F(xiàn)ISH）是指以熒光標記的寡核苷酸探針與處理后的微生物內目標序列以堿基互補配對原則雜交，再通過熒光顯微鏡觀察目標基因微生物的細胞形態(tài)，分布以及數(shù)量的可視化技術［13］。然而，F(xiàn)ISH 普遍存在檢測靈敏度低、雜交效率低和高背景干擾等缺點。FISH雜交效果取決于細胞大小、生長速率、細胞核糖體含量、靶位點的可及性以及每個細胞的rRNA操縱子拷貝數(shù)等因素；FISH 技術適用于鑒定有高核糖體含量的微生物，而由于休眠或生理活性低而無法檢測出具有低核糖體含量的微生物［14］。

CARD?FISH 是FISH的進一步完善，CARD反應后信號顯著放大，其信號強度比單熒光標記探針強10 倍以上［7，15］，因此更適用于緩慢生長的寡聚微生物的實時測定。當目標菌群包含大量的rRNA時，使用CARD?FISH 的檢測率反而可能會低于使用FISH 的檢測率。mRNA 分子不穩(wěn)定，以較低的拷貝數(shù)存在。DNA 雖比mRNA 穩(wěn)定得多，但是目的基因的拷貝數(shù)通常也很低。因此，mRNA 和DNA 更適合用CARD?FISH 檢測。不同于FISH 中核酸探針直接被熒光標記，CARD?FISH操作中帶有辣根過氧化物酶（HRP）的探針首先與細胞中目標序列雜交，再加入H2O2和熒光標記的酪酰胺（tyramide），使熒光標記的酪酰胺在HRP 周圍大量沉淀［7,16］。在H2O2存在下，HRP 將熒光標記的酪酰胺轉化為自由基的醌類結構中間體，該中間體和芳香化合物（如酪氨酸、色氨酸）在細胞內反應。該反應只在HRP 附近快速發(fā)生，這導致大量熒光標記的酪酰胺沉淀在HRP 周圍，起到放大熒光信號的作用，同時減少了背景干擾，增強了熒光的穩(wěn)定性（圖1）［17］。

2 CARD?FISH的研究進展

圖1 FISH和CARD?FISH的主要步驟Figure 1 The main steps of FISH and CARD?FISH

Pernthaler等［18］優(yōu)化靶細胞的通透性，使用CARD?FISH 對海洋細菌檢出率（85%～100%）顯著高于使用Cy3 標記的探針進行FISH 的檢出率（9%～66%）［8］。CARD?FISH 在微生物系統(tǒng)發(fā)育、微生物診斷和環(huán)境微生物生態(tài)學研究中應用較多，可鑒定微生物的種類、數(shù)目以及空間分布等。研究表明，CARD?FISH 的應用從以往的全細菌或門水平的研究逐步向環(huán)境中功能微生物的可視化、定位及活性方面的研究轉移（表1）。Cai等［19］對水稻土壤中Ⅰ型、Ⅱ型甲烷氧化菌的定位說明它們在稻田土壤中的“高親和力”甲烷氧化活性的出現(xiàn)和恢復中的作用，為稻田生態(tài)系統(tǒng)中甲烷的周期性吸收提供證據(jù)。Probandt 等［20］對沙粒進行16S rRNA 測序并在此基礎上利用CARD?FISH 獲得單個沙粒表面微生物的直觀原位信息。隨著各類技術的層出不窮，CARD?FISH 越來越傾向于與其他技術聯(lián)用。Dekas等［21］首次利用FISH 與nanoSIMS 結合的方法證實海洋沉積物中存在厭氧甲烷氧化古菌，能夠代謝13C?CH4。Zhu 等［22］利用CARD?FISH 與流式細胞儀（Flow cytome?ter，F(xiàn)CM）相結合用于厭氧污泥樣品中厭氧氨氧化細菌豐度的定量。

CARD?FISH 用于根系微生物（包括根內生菌和根表面菌）定植策略的研究相繼報道。Bulgarelli 等［23］對無植被土壤、擬南芥根際土、擬南芥根和表面滅菌和粉碎的種子中的菌群進行16S rRNA 基因測序，結果表明Actinobacteria（放線菌門）在無植被土壤中存在，但在表面滅菌和粉碎的種子中不存在；進一步利用CARD?FISH 對根內占優(yōu)的3 個門細菌在無植被土、根際土和無菌根及擬南芥根表面進行定位，結果表明在根內占優(yōu)的3 個門細菌在擬南芥根表面有明顯信號，在無植被土壤和根際土樣品中有信號但比全菌信號明顯低，在無菌根系未檢測到信號，這暗示擬南芥根表面定植物的細菌來源于接種土壤的細菌，并且土壤類型在很大程度上定義了擬南芥根系細菌群落的組成。 Rein?hold?Hurek等［24］通過CARD?FISH驗證了不同方法去除擬南芥和水稻根表面微生物的效果，結果顯示NaClO處理對研究內生菌群落有較好效果，但要以低估內生菌數(shù)量為代價。Posada 等［25］對比了FISH 和CARD?FISH對枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis EA?CB0575 在香蕉和番茄根部定植和生長促進的研究，結果顯示CARD?FISH 更具優(yōu)越性。然而有研究報道，與測序技術相比，基于細胞染色的FISH 和CARD?FISH 技術涉及的一系列操作過程，通常對細胞計數(shù)造成較大誤差［26］。本課題組按照上述實驗方法多次對水稻、蘆葦根系甲烷氧化菌微生物進行CARD?FISH 定位研究。圖2和圖3 分別為水稻根甲烷氧化菌和全細菌的原位定植信息?？梢灾庇^看到Ⅱ型甲烷氧化菌在水稻根表皮細胞［圖2（b）］和維管柱［圖2（c）］分布，而根表面全細菌分布于根組織細胞壁的周圍或整個表皮細胞表面（圖3），推測可能是由于菌群繁盛形成生物膜覆蓋在水稻根表面［圖3（c）］。然而CARD?FISH 單獨使用僅能提供微生物的定植與基本的生態(tài)學信息，還需與其他技術相結合發(fā)揮其潛力。

表1 CARD?FISH在不同生境中的應用Table 1 Application of CARD?FISH in different habitats

圖2 CARD?FISH檢測水稻根內生Ⅱ型甲烷氧化菌Figure 2 CARD?FISH detection of type Ⅱmethane?oxidizing bacteria of rice endorhizosphere

3 CARD?FISH與其他技術聯(lián)用

3.1 根相關微生物研究方法

根際是復雜且高度動態(tài)的環(huán)境，其中根、礦物質、有機化合物、溶質、氣體、微生物之間存在大量相互作用并驅動著元素的生物地球化學循環(huán)。根還能產(chǎn)生成分復雜的分泌物為根際微生物提供豐富的營養(yǎng)物質，對根系微生物的群落結構和代謝方式產(chǎn)生巨大影響［2］。但復雜的微生物群落及代謝網(wǎng)絡為根相關微生物的研究帶來巨大挑戰(zhàn)，這使得對根際微生物、根際分泌物、根際營養(yǎng)物質的循環(huán)等因素的分析成為生態(tài)環(huán)境研究的重要任務［2］。根據(jù)原理的不同，研究方法可以大致分為微生物學方法、同位素方法、呈像法三類［4］（表2）。

目前，大多數(shù)植物微生物組研究要么使用基于擴增子測序的方法來描述群落結構，要么局限于模式植物的病原體或有益微生物［5］。為提高對植物及其微生物群落之間相互作用的理解，需將重點從群落結構的描述轉向對微生物代謝功能的理解。隨著分子生物學方法的進步，組學技術在一定程度上加深了人們對根相關細菌在功能菌群中的見解。根據(jù)研究對象的不同，組學可分為宏基因組學（Metagenomics）、宏轉錄組學（Metatranscriptomics）、宏蛋白組學（Metaproteomics）和代謝組學（Metabolomics）［4］。有人提出：“基因組學反映了什么是可以發(fā)生的，轉錄組學反映的是將要發(fā)生的，蛋白質組學指出了賴以發(fā)生的，代謝組學反映真正已發(fā)生的?！倍鴨渭毎麥y序技術作為宏組學技術的補充，可以對無法培養(yǎng)的單個細菌進行基因組測序，提供稀有微生物的遺傳信息［5］。轉錄組學分析能夠檢測到主動轉錄的基因，在活性分析上比宏基因組測序更具優(yōu)勢。蛋白質組學測量的是細胞產(chǎn)生的功能蛋白成分，因此它能提供微生物代謝活性途徑的更精確快照［4］。使用靶向或非靶向性的代謝組學，可以測量特定處理下一定水平的代謝產(chǎn)物的變化。但由于植物?微生物系統(tǒng)中的代謝組學分析存在許多挑戰(zhàn)，因此尚未被廣泛采用［5］。

微生物負責驅動地球上元素的生物地球化學循環(huán)。穩(wěn)定同位素是跟蹤碳氮、營養(yǎng)物和污染物的吸收和釋放，儲存以及在植物、土壤和相關微生物之間的轉移過程的優(yōu)良標記物［4］。常用的穩(wěn)定同位素方法包括穩(wěn)定同位素分餾（Stable isotope fractionation，SIF）和穩(wěn)定同位素探針（Stable isotope probing，SIP）［31］。SIF 常用來確定微生物驅動的碳氮循環(huán)或污染物的遷移轉化以及在植物、土壤和相關微生物之間的相關轉移過程［32］。SIP 是指將同位素標記的底物（13C、15N 等）引入植物?土壤系統(tǒng)以追蹤其分配和命運，該技術可用于識別原位發(fā)生的積極參與特定代謝過程的微生物［31］。由于擴增子測序、宏轉錄組或宏蛋白質組學分析都不一定能反映微生物活性和養(yǎng)分周轉情況，將來，利用高通量測序或“宏組學”與穩(wěn)定同位素技術的組合方法揭示根與微生物之間的相互作用是必要的。

通過組學技術或同位素技術確定根相關功能菌群在空間分辨率上受限，并且可能無法在生物學水平上原位識別相關過程，可視化技術極大地幫助了我們對原位根際動態(tài)的理解。CARD?FISH 在微生物系統(tǒng)發(fā)育、微生物診斷和環(huán)境微生物生態(tài)學研究中應用較多，可鑒定微生物的種類、數(shù)目以及空間分布等。同位素呈像技術nanoSIMS 的應用能夠在單細胞水平上提供微生物的生理生態(tài)特征信息，而且能夠準確識別在復雜環(huán)境樣品中的代謝活躍的微生物細胞信息，對于元素生物地球化學循環(huán)機制具有重要意義［33］。CARD?FISH 能提供包括未培養(yǎng)微生物在內的微生物分布以及系統(tǒng)發(fā)育分類，通過與其他技術聯(lián)用，如組學技術、nanoSIMS、流式細胞儀（FCM）等還可以在單細胞水平上獲得其原位代謝信息并實現(xiàn)關鍵菌種分離。

表2 研究植物?微生物相互作用方法簡介［4］Table 2 Introduction to methods for studying plant?microbe interactions［4］

3.2 CARD?FISH的聯(lián)用技術

CARD?FISH 通過熒光顯微鏡呈現(xiàn)微生物在根部的原位定植策略，但單獨使用無法判斷微生物活性。CARD?FISH 與微生物學方法的共同應用可在不同水平獲得功能微生物原位代謝活性信息。保守標記基因（如16S rRNA）的擴增子測序與CARD?FISH 共同應用可檢測微生物群落成員的存在性（DNA）和潛在活性（反轉錄RNA）以及重要類群的定位。Lundberg等［8］對不同土壤類型和不同基因型擬南芥根際和根內生菌群進行16S rRNA 基因測序結果表明Actinobacteria（放線菌門）是擬南芥主要的內生菌群之一，并通過CARD?FISH 定位了根表面的Actinobacteria，表明內生Actino?bacteria來自于根表，而CARD?FISH與蛋白質組學的共同應用可以在定位的基礎上提供有關微生物群落和植物功能活性的信息。多數(shù)固氮菌固氮活性需要低氧條件，而水稻根系中心柱氧分壓高于表皮，因此表皮上的甲烷氧化菌可能主導固氮活性。分離菌株的固氮活性實驗表明，II 型甲烷氧化菌的固氮活性不受氧分壓的影響，推測其在水稻根系不同部位都可能固氮［12，34］。但是，擴增子測序、宏轉錄組和宏蛋白質組學分析都不能確切反映微生物活性和養(yǎng)分周轉率。因此，高通量和組學技術與穩(wěn)定同位素分析技術的組合方法是揭示根與根相關微生物之間相互作用的有效辦法。

了解微生物代謝的一種好方法是分離純培養(yǎng)微生物，但是，據(jù)實驗室估計，可培養(yǎng)微生物的比例僅為現(xiàn)有微生物的0.1%至10%。如果能夠直接觀察單細胞水平的底物攝取，則可以了解不可培養(yǎng)微生物的代謝功能［35］。同位素呈像nanoSIMS 技術具有超出單細胞（50～100 nm）的分辨率，使nanoSIMS 成為揭示亞微米級根際植物?微生物相互作用必不可少的工具［4］。顯微呈像CARD?FISH 技術、同位素示蹤技術以及nanoSIMS 技術結合使用不僅能夠在單細胞水平上提供微生物的生理生態(tài)特征信息和空間分布，還能準確識別復雜環(huán)境樣品中微生物的代謝功能活性，對于理解微生物介導的元素生物地球化學循環(huán)具有重要意義［36］。Behrens 等［37］通過元素標記的FISH 技術（Ele?ment labeling?FISH，EL?FISH）與nanoSIMS 聯(lián)用評估了多種環(huán)境下已知或未知微生物的生理生化特性。Dekas 等［22］利用轉錄組和FISH?nanoSIMS 技術揭示了火山泥富集液中甲烷氧化古菌（ANME）和δ?變形菌（Deltaproteobacteria）的甲烷氧化和固氮活性的互作關系。然而利用CARD?FISH 與nanoSIMS 聯(lián)用揭示根系微生物介導的原位活性實驗及植物微生物互作機制的研究鮮有報道。用于nanoSIMS 分析的根際樣品的制備通常包括固定、包埋、染色等多個步驟，這對結果的影響仍然是一個至關重要的問題，并且nanoSIMS 應用的廣泛性還受到全球儀器數(shù)量的限制。另外，CARD?FISH 還可與微放射自顯影（microautoradiography，MI?CRO）聯(lián)用。

除了探索微生物的代謝活性，挖掘環(huán)境中未培養(yǎng)微生物，更新和完善微生物數(shù)據(jù)庫也是目前的重要任務之一?；跓晒庠浑s交技術和16S rRNA 基因測序技術的單細胞分離方法還可用于未培養(yǎng)微生物的分離。首先從環(huán)境樣品中提取細菌細胞，通過16S rRNA 基因測序構建系統(tǒng)發(fā)育樹了解物種信息，根據(jù)16S rRNA 基因序列設計特異性探針用于CARD?FISH 識別提取的細菌細胞中的目標細胞，再通過顯微操作（Micro?manipulator）或流式細胞儀（FCM）獲取該單細胞，進而進行單細胞測序獲得相關基因和代謝途徑［38］。Ozawa 等［39］利用流式細胞熒光分選技術（flow cytometry and fluorescence?activated cell sorting，F(xiàn)CM?FACS）從水樣中分離出31種致病菌。

4 展望

許多有趣的微生物作用都發(fā)生在植物組織中，但這些細胞即使在共聚焦顯微鏡下也很難被觀察到。CARD?FISH 具有其獨特優(yōu)勢，尤其在包括未培養(yǎng)根系微生物的定植和系統(tǒng)發(fā)育分類方面。但單獨使用CARD?FISH 很難達到對復雜環(huán)境中微生物生理活性研究的目的，CARD?FISH 的聯(lián)用技術為微生物生態(tài)學研究提供了新的機遇。但CARD?FISH 技術仍存在一些問題，非生物顆粒干擾、細胞通透性及其對染色物質的吸收、顯微設備的檢測效率等會對實驗結果產(chǎn)生一定影響。以根系微生物的檢測為例，在選擇準確的特異性探針的前提下，延長（10 h 左右）根系微生物固定時間對后期的細胞通透性處理及后期處理打下基礎，此外利用H2O2失活植物來源（內源）的辣根過氧化物酶的濃度對準確檢測目標微生物也至關重要。但是，根系微生物是否在原位具有活性以及根系微生物與植物的互作機制尚不清楚。今后還應在以下幾個方面進行深入研究：（1）未來有必要開展CARD?FISH 和nanoSIMS 等技術相結合的植物根系菌群的原位活性實驗以及通過接種實驗分析特殊菌群與植物相互作用的研究；（2）隨著CARD?FISH 與nanoSIMS 聯(lián)用技術越來越多地用于定量評估特定微生物種群對特定的生化過程的貢獻，全面評估可能造成誤差的樣品制備步驟至關重要；（3）另外，CARD?FISH 和其他方法的聯(lián)用不僅適用于根系微生物研究，還可以應用于環(huán)境中微生物介導的物質循環(huán)及微生物之間的互作以及未培養(yǎng)微生物的基因組測序及分離等；（4）雖然以測序組學、CARD?FISH、流式細胞分離、熒光激活細胞分離技術等為代表的先進技術高速發(fā)展，但一些傳統(tǒng)方法也不能完全摒棄，應該將多種技術相結合，為探究環(huán)境中微生物分布和多樣性、生態(tài)學功能以及豐富微生物數(shù)據(jù)庫等提供新的技術支持。