瀕危植物大花黃牡丹種胚快速成苗技術(shù)研究

尹 秀，張二豪，李 芳，楊 雪，蔡 皓，祿亞洲1，

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院高原生態(tài)研究所，林芝860000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院?西南大學(xué)藥用植物聯(lián)合研發(fā)中心，林芝860000；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，林芝860000）

毛茛科芍藥屬大花黃牡丹（Paeonia ludlowii（Stern et Taylor）Hong）為西藏特有瀕危植物，其黃色花大且色艷［1］，具有重要的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值，其根部含有丹皮酚，為常用藏藥。大花黃牡丹生存條件極為苛刻［1?2］，為叢生灌木［3］，屬國家二級(jí)瀕危植物，喜溫和氣候，較耐寒，抗旱能力較弱［4］。目前，有關(guān)大花黃牡丹的研究主要集中在分類學(xué)［5］、生態(tài)學(xué)［6］、栽培學(xué)［4］、孢粉學(xué)［7］、病理學(xué)［8］、生理學(xué)［9］和形態(tài)學(xué)［10］等方面，而有關(guān)植物組織快繁方面的研究尚鮮見報(bào)道。

大花黃牡丹種子繁殖時(shí)，播種當(dāng)年上胚軸休眠，只生根不發(fā)芽，第二年才發(fā)芽，育苗時(shí)間長，從而限制了種群的更新和發(fā)展［11］。雖然能通過物理和化學(xué)藥劑處理［12?17］提高萌發(fā)率及縮短萌發(fā)時(shí)間，但效果有限，育苗周期仍較長，且受季節(jié)限制。本研究探索將植物組織培養(yǎng)技術(shù)運(yùn)用于大花黃牡丹的繁育，以提高成苗率及縮短育苗周期，大量繁育幼苗，提高大花黃牡丹幼苗的種群數(shù)量。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年9月底于西藏自治區(qū)林芝市南伊溝采集大花黃牡丹果莢，采集后置于陰涼通風(fēng)處，外種皮發(fā)黑時(shí)轉(zhuǎn)至室外暴曬，備用。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒

將種子轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，倒入無菌瓶中，加入75%乙醇，消毒30 s，無菌水沖洗1 次，0.1%升汞消毒12～15 min，無菌水沖洗3～5次，室溫浸泡2 d，備用。

1.2.2 不同的接種方法

方法1：對(duì)照組，不進(jìn)行任何處理，直接接種；方法2：去種皮，即剝?nèi)シN皮后接種至培養(yǎng)基上；方法3：縱切種子，暴露出胚且保持胚的完整性，接種時(shí)切面不接觸到培養(yǎng)基；方法4：橫切種子，將帶有胚和部分胚乳接種于培養(yǎng)基；方法5：剝?nèi)シN皮及胚乳，分離出種胚，接種至培養(yǎng)基表面。種子經(jīng)過以上5 種方法處理后，分別接種至以下10 種不同的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，基本培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉，pH 6.0。每瓶接種5粒，每種方法各接種5瓶。

接種后轉(zhuǎn)至培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度為18 ℃～20 ℃、光照強(qiáng)度為1 000～2 000 lx、14 h光照/10 h黑暗。

1.2.3 生根培養(yǎng)

將培育出的無菌苗轉(zhuǎn)接到7 種生根培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基為1/2MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉，pH 6.0。培養(yǎng)條件為18 ℃～20 ℃、1 000 lx、14 h光照/10 h黑暗。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

接種3 d后，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，萌發(fā)率（%）=胚萌發(fā)數(shù)量/接種數(shù)量×100%。待長出真葉時(shí)，統(tǒng)計(jì)成苗率，成苗率（%）=幼苗數(shù)量/接種數(shù)量×100%。待幼苗長出明顯的根時(shí)，統(tǒng)計(jì)生根率，生根率（%）=生根幼苗數(shù)量/接種數(shù)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體處理方式對(duì)幼苗誘導(dǎo)的影響

將經(jīng)過5 種方法處理的大花黃牡丹外植體接種到不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，通過各實(shí)驗(yàn)組的萌發(fā)率和成苗率對(duì)比，剝離種胚，直接將種胚接種到MS 培養(yǎng)基上，萌發(fā)率和成苗率均達(dá)到最大值，分別為59.60%和51.75%，表明此處理方法為外植體的最優(yōu)處理方法（表1）。方法5 培養(yǎng)6～9 d，種胚開始萌動(dòng)，10 d種胚萌發(fā)，18 d子葉抽出，長約1～2 cm。

表1 不同處理方式對(duì)幼苗誘導(dǎo)的影響Table 1 The effect of different treatment methods on seedling induction

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對(duì)幼苗的誘導(dǎo)效果

種胚培養(yǎng)的最優(yōu)激素配比為：MS+0.5 mg/L 6?BA+0.5 mg/L IAA+0.2 mg/L GA3，萌發(fā)率和成苗率達(dá)到最大值，分別為72.25%和70%（表2）。將胚接種到上述培養(yǎng)基上培養(yǎng)（圖1），3～5 d 種胚開始萌動(dòng)（圖2），7 d 種胚萌發(fā)，15 d 子葉抽出（圖3），長約1～4 cm，30 d胚根抽出，然后將大花黃牡丹的無菌苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上1/2 MS+1 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA 培養(yǎng)生根（圖4），生根率高達(dá)93%（表3）。

2.3 無菌苗的煉苗移栽

待無菌苗苗齡達(dá)到2～3 個(gè)月，幼苗高約5 cm（圖5），打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋，煉苗1～2 周，移栽到透氣性好經(jīng)滅菌的腐殖土中（圖6），15 ℃～18 ℃，避光、濕度為45%～60%的環(huán)境中培養(yǎng)，2 周后，逐漸降低濕度，待長出新根或新葉后轉(zhuǎn)至強(qiáng)光下培養(yǎng)。

3 討論與結(jié)論

牡丹組植物種子均具有休眠萌發(fā)特性，包括上胚軸及下胚軸休眠，且上胚軸休眠更為突出［18?20］。早在13 世紀(jì)初，便提出種子推遲發(fā)芽與抑制物質(zhì)有關(guān)［20?24］。一些產(chǎn)生于植物種子內(nèi)部或外部的有機(jī)酸、酯類、醛類、生物堿和脫落酸等物質(zhì)通過抑制種子的酶活性、抑制呼吸、阻礙胚生長等，間接抑制種子的萌發(fā)［25?30］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)剝?nèi)シN皮和胚乳，分離種胚，直接將種胚接種到MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)率和成苗率菌達(dá)到最大值，分別為59.6%和51.75%，培養(yǎng)6～9 d，種胚開始萌動(dòng)，10 d 種胚萌發(fā)，18 d 子葉抽出，長1～2 cm，2～3 個(gè)月成苗。

表2 不同濃度培養(yǎng)基對(duì)胚芽誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different concentration mediums on embryo induction

表3 不同濃度培養(yǎng)基對(duì)胚根誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different concentration mediums on radicle induction

傳統(tǒng)播種育苗周期為2 年，大花黃牡丹種子繁殖時(shí)，播種當(dāng)年上胚軸休眠，只生根不發(fā)芽，第二年才發(fā)芽，育苗時(shí)間長。綜上所述，表明大花黃牡丹種皮和胚乳中可能存在抑制種胚萌發(fā)或誘導(dǎo)種胚休眠的物質(zhì)，有待進(jìn)一步深入研究。

本研究中，大花黃牡丹種子的成苗率能夠達(dá)到70%，相比大花黃牡丹自然狀態(tài)下種子繁殖時(shí)種子發(fā)芽率和成苗率（低于5%）［3］提高了60%～65%。人工播種，大花黃牡丹的種子成苗周期為兩年（第一年胚根萌發(fā)，第二年子葉萌發(fā)），通過此方法種子的成苗周期為3個(gè)月，大大縮短了大花黃牡丹種子育苗的周期。

圖1 種胚的萌動(dòng)Figure 1 Germination of an embryo

圖2 胚芽的萌發(fā)Figure 2 Germination of germ

圖4 誘導(dǎo)生根Figure 4 Induced rooting

圖5 獲得無菌苗Figure 5 Obtaining sterile seedlin g

圖6 無菌苗的移栽Figure 6 Transplanting of sterile seedling