基于絲素纖維的體育運動康復(fù)材料改性及應(yīng)用研究

馬雪明

（長安大學(xué)，陜西西安710021）

在體育運動中，韌帶受傷是常見的運動損傷現(xiàn)象。對于輕微的體育運動損傷，韌帶一般可進(jìn)行自我修復(fù)，但對于嚴(yán)重的體育運動韌帶損傷，通常則需要進(jìn)行手術(shù)修復(fù)。因此，研究新型的用于運動康復(fù)的人工韌帶材料，是當(dāng)前新材料領(lǐng)域思考和研究的熱點。而關(guān)于人工韌帶的研究中，馮思嘉等研究了蠶絲生物材料在肌骨方面的應(yīng)用［1］；荊曉偉等則從硅網(wǎng)支具對前交叉韌帶損傷的修復(fù)效果進(jìn)行探討［2］；趙立連等對Endobutton 袢鋼板與Rigidfix 橫穿釘股骨端固定自體腘繩肌腱重建前交叉韌帶的轉(zhuǎn)歸做出了研究［3］；吳佳蔚等提出編織型絲素纖維人工韌帶可作為天然韌帶替換材料［4］，但編織型絲素纖維人工韌帶在生物力學(xué)性能上與天然韌帶還是有所差異。因此，尋找可替換的人工韌帶材料是當(dāng)前運動康復(fù)材料領(lǐng)域中的重點。本研究則在以上研究的基礎(chǔ)上，嘗試對絲素纖維人工韌帶進(jìn)行涂層改性及體外礦化，以求尋找一種穩(wěn)定效果更好的韌帶替代材料。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

實驗主要試劑見表1。

表1 實驗主要試劑信息Table 1 Main reagent information

1.2 試驗儀器

本實驗主要儀器見表2。

表2 實驗主要儀器信息Table 2 Main instrument information

1.3 試驗方法與過程

1.3.1 “12×12”結(jié)構(gòu)人工韌帶編織

為避免蠶絲的免疫原性對人工韌帶造成影響［5］，在編織人工韌帶過程中先進(jìn)行脫膠，將絲膠除去。具體步驟為：首先將NaNO3溶液和編織紗置于超聲波清洗機中振蕩，振蕩時間為12min; 然后用去離子水結(jié)合超聲波清洗機再次進(jìn)行振蕩清洗；最后進(jìn)行搓洗。重復(fù)以上步驟三次，直到編織紗表面無滑膩感即可。隨后，將脫膠后的編織紗纏繞在12 個編織機錠子上進(jìn)行編織，得到脫膠后“12×12”結(jié)構(gòu)人工韌帶。具體過程如圖2 所示。

圖1 “12×12”結(jié)構(gòu)人工韌帶編織流程圖Fig. 1 Braiding flow chart of "12 × 12" artificial ligament

在上述實驗組的基礎(chǔ)上，設(shè)置1 組對照組，即將未脫膠的編織紗直接放在12 錠的編織機上進(jìn)行編織，從而得到未脫膠的“12×12”結(jié)構(gòu)的蠶絲人工韌帶。

1.3.2 涂層制備及人工韌帶改性

（1） 絲素蛋白（SF）制備及涂層改性

挑選清潔的蠶繭，去除內(nèi)表面的污濁和外表面松散的繭衣，然后將其剪為1/4 指甲蓋大小，并放置在恒溫恒濕下24h。配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% 的Na2NO3溶液，在95℃和1∶50 的浴比下，用AS-12 染色機中進(jìn)行脫膠處理，脫膠時間和脫膠頻率分別為35min 和60 r/min；取出脫膠后的混合物溶液，在60 ℃的超聲波清洗機中進(jìn)行清洗，清洗時間為12min；然后用去離子水進(jìn)行超聲清洗；最后進(jìn)行搓洗。同樣根據(jù)1.3.1 的制備原理，重復(fù)以上步驟三次。將得到的松散纖維放在錫紙上，并用40 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行干燥，干燥時間設(shè)定在 2～3 h；將干燥后的成品用9.3 mol/L 的 Li Br 溶液在染色機中進(jìn)行溶解，溶解時間1h，水浴比為1:10，溶解溫度為95 ℃。將上述溶液進(jìn)行過濾，裝入8000～14000 分子量的透析袋中進(jìn)行透析，透析時間為72h，每隔4.5h 更換一次去離子水。透析完的溶液以 6000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心 5 min，取上清液，冷凍干燥 72 h，得到再生絲素蛋白膜。

在上述步驟的基礎(chǔ)上，用絲素蛋白（SF）涂層對人工韌帶進(jìn)行改性。具體步驟為：將人工韌帶在75 % 乙醇溶液中進(jìn)行清洗，然后用去離子水進(jìn)行清洗，并用GZX-GF101 電熱鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行風(fēng)干；取上述制備得到的絲素蛋白，分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%、4%的溶液。

將以上人工韌帶樣品分別放入4℃下的不同濃度的絲素蛋白溶液浸泡，浸泡時間為14h；取出樣品后，用PBS 磷酸鹽緩沖液片劑溶液浸潤，并進(jìn)行真空干燥。為鞏固涂層，再次將處理好的樣品放入75 % 的乙醇溶液中浸泡2h，然后進(jìn)行真空干燥24h，得到不同濃度的SFAL-SF 組。

（2） 海藻酸鈉（SA）涂層對人工韌帶的改性

將海藻酸鈉分別配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%、4% 溶液，然后根據(jù)絲素蛋白的改性步驟對人工韌帶進(jìn)行改性，得到不同濃度SFAL -SA 組。

（3） 絲素蛋白/海藻酸鈉（SF/SA) 復(fù)合涂層改性

選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)都為1%的SF、SA 溶液，并按照2:8、4:6、5:5、6:4、8:2 的比例混合，將混合后溶液進(jìn)行磁力攪拌，攪拌時間為35min。得到不同比例的SF/SA 混合溶液。將混合溶液放置于4℃的環(huán)境中靜置12h，讓混合溶液穩(wěn)定。然后根據(jù)絲素蛋白的改性步驟對人工韌帶進(jìn)行改性，得到不同比例SFAL -SF/SA 組。

1.3.3 礦化處理

利用交替浸漬法對經(jīng)改性和未經(jīng)改性的樣品進(jìn)行體外礦化處理［6-7］。將礦化樣品放入200md/L 的CaCl2溶液中。樣品隨CaCl2溶液在37℃恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩，振蕩速率為150r/min，振蕩時間為1h。振蕩結(jié)束后將樣品取出，吸干表面水分后放入120mol/L 的(NH4)HPO4溶液中，在37℃恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩，振蕩速率為150r/min。重復(fù)以上步驟三次后將樣品取出，用去離子水沖洗，并吸干表面水分。將樣品隨油紙放入真空干燥箱進(jìn)行干燥，干燥溫度為25℃，干燥時間為24h。得到礦化后SFAL-CaP、SFAL-SF-CaP、SFAL-SA-CaP、SFAL-SF/SA-CaP 組。

1.4 性能測試試驗

1.4.1 力學(xué)性能指標(biāo)

用多功能強力儀對脫膠前后人工韌帶、復(fù)合溶液涂層改性后的人工韌帶及復(fù)合溶液涂層改性礦化后的人工韌帶進(jìn)行拉伸試驗，測出斷裂強力、斷裂強度及斷裂伸長值，然后利用公式（1）計算出斷裂伸長率［8-9］，從而得到檢測樣品的力學(xué)性能數(shù)據(jù)。

式（1）中，e 表示斷裂伸長率，L0為式樣原來的長度， La為斷裂伸長。

1.4.2 涂層及礦化結(jié)果表征

（1）SEM（掃描電鏡）

將樣品處理成SEM 需要的大小，并用導(dǎo)電膠將樣品固定在電鏡臺上。在樣品上噴涂一層鉑金，以增強樣品的導(dǎo)電性。用JSM-IT200 電子顯微鏡對處理好的樣品涂層和礦化物形態(tài)進(jìn)行表征，設(shè)置加速電壓為10kV。用Image-Pro Plus 軟件對SEM 圖像進(jìn)行處理，可測量沉積物顆粒直徑。

（2）FTIR（紅外光譜）

使用iCAN 9 型傅里葉變換紅外光譜儀結(jié)合衰弱全反射法，對樣品進(jìn)行測試。為保證實驗的準(zhǔn)確性，掃描次數(shù)應(yīng)不小于5 次。

1.4.3 SF/SA 固體表面Zeta 電位測試

在pH 值=6、7、8 環(huán)境下，利用固體表面Zeta 電位測試儀對SFAL、SFAL-1%SF、SFAL-1%SA、SFALSF∶SA=4∶6、SFAL-SF∶SA=5∶5、SFAL-1%SF-CaP、SFAL-1%SA-CaP、SFAL-SF ∶SA=4∶6-CaP 和SFALSF∶SA=5∶5-CaP 進(jìn)行表面Zeta 電位測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工韌帶力學(xué)性能

本文對脫膠前后人工韌帶力學(xué)性能進(jìn)行了統(tǒng)計，結(jié)果見表3。

表3 人工韌帶脫膠前后力學(xué)性能對比Table 3 Comparison of mechanical properties of artificial ligament before and after degumming

通過表3 可知，脫膠后，韌帶的力學(xué)性能會發(fā)生一些改變，但對解剖兔韌帶力學(xué)性能分析，脫膠后的人工韌帶仍與之相近，能達(dá)到移植所需的力學(xué)要求。

2.2 涂層及礦化結(jié)果表征

2.2.1 涂層SEM 形貌分析

圖2 為SFAL(a)、SFAL-SF(b)、SFAL-SA(c) 及SFAL-SF/SA(d)涂層的SEM 圖像。通過圖2 進(jìn)行涂層的形貌分析可發(fā)現(xiàn), 脫膠后的絲素纖維(a) 表面并無絲膠殘留且內(nèi)部纖維相互獨立，（a）～(c) 樣品表面皆有漿料包覆感，且內(nèi)部纖維相互粘連，涂層效果一樣。

圖2 SEM 圖像Fig. 2 SEM images

2.2.2 沉積物形貌分析

圖3 為單種涂層樣品礦化物SEM 結(jié)果，其中（a）為未經(jīng)涂層改性的樣品礦化物SEM 結(jié)果，（b）～(e) 為經(jīng)SF 改性后礦化物SEM 結(jié)果，（f）～（i）為經(jīng)SA 改性后礦化物SEM 結(jié)果。分析發(fā)現(xiàn)：未經(jīng)涂層改性的樣品礦化物不能完全包裹纖維。經(jīng)SF 涂層改性后的樣品，出現(xiàn)礦化物分布不均勻的情況，這是由于SF 涂層在纖維表面分布不均勻?qū)е翪aP 分布不均勻?qū)е碌模粚Ρ葓D3 中（b）～(e)圖像可以發(fā)現(xiàn)，0.5%、1.0%沉積顆粒較均勻，2%、4% 的沉積物顆粒大小不一，有脫落風(fēng)險。對比圖3 中（f）～（i）圖像可知，SA 涂層完全包裹纖維表面，CaP 之間呈相互連接的狀態(tài)，纖維內(nèi)部也有沉積物。隨著SA 濃度的增加，礦化物加厚，有掉落風(fēng)險，且隨SA濃度增加，纖維內(nèi)部沉積物含量增加，可能會填充到骨骼內(nèi)部的空隙中，對骨骼的恢復(fù)造成影響。綜上所述，1%的SF 和SA 涂層效果最佳，故復(fù)合涂層分別采用1% 的SA、SF 配制而成。

圖3 礦化物的SEM 結(jié)果Fig. 3 SEM results of mineralization

圖4 為不同比例SF/SA 復(fù)合涂層礦化物SEM 結(jié)果，（a）～（e）分別代表SF 與SA 比例為2:8、4:6、5:5、6:4、8:2 時的SEM 圖像，觀察圖4 可以發(fā)現(xiàn)，復(fù)合涂層能改善單組涂層的缺點，沉積物能很好地附著在樣品表面。當(dāng)SF 與SA 比例為4:6、5:5 時，沉積物能夠覆蓋纖維表面，且顆粒均勻，能促進(jìn)骨骼的愈合。

圖4 不同比例的復(fù)合涂層礦化SEM 結(jié)果Fig. 4 SEM results of mineralization of composite coatings with different proportions

2.2.3 FTIR 分析

圖5 為SFAL、SFAL-SF、SFAL-SA 及SFAL-SF/SA 的紅外譜圖。通過觀察圖5 可知，SF 與SA 涂層的引入讓靜電感應(yīng)和振動頻率增加，導(dǎo)致1620cm-1酰胺I特征峰出現(xiàn)偏差到1633cm-1，同時因為SA 的存在，導(dǎo)致復(fù)合涂層在1227cm-1處的峰不明顯。

圖5 紅外譜圖Fig. 5 Infrared spectra

圖6 為SFAL-SF/SA-CaP、SFAL-CaP、SFAL-SFCaP、SFAL-SA-CaP 的紅外譜圖對比，分別在1024cm-1、607cm-1及563cm-1處出現(xiàn)波動。具體原因是PO43-在不同化學(xué)環(huán)境下分子振動導(dǎo)致，證實了礦化物中CaP 的存在。

圖6 人工韌帶礦化后的紅外譜圖Fig. 6 Infrared spectra of mineralized artificial ligament

2.3 固體表面Zeta 電位測試

測試結(jié)果如表4 所示。根據(jù)表4 結(jié)果看出，全部樣品都帶負(fù)電，只是其中的SFAL-1%SF 樣品在pH=7 和8下，以及SFAL 樣品在pH=8 下的負(fù)電荷帶電量較大，其余樣品所帶的負(fù)電荷都相差不大，沒有明顯的差異。根據(jù)以上數(shù)據(jù)說明，絲素蛋白在堿性的環(huán)境下很容易產(chǎn)生負(fù)電荷，比天然的絲素纖維更為敏感，且更具有穩(wěn)定性。

表4 固體表面Zeta 測試結(jié)果(V)Table 4 Zeta test results on solid surface

2.4 力學(xué)性能

圖7 是未脫膠(SAL)、脫膠后(SFAL)、復(fù)合涂層改性(SFAL-SF/SA)及復(fù)合涂層礦化后(SFAL-SF/SA-CaP )的力學(xué)性能對比。分析圖7 可知，脫膠對最大斷裂強力有所影響，經(jīng)涂層處理后有所回升。而經(jīng)過涂層改性結(jié)合礦化處理后，斷裂強力達(dá)到最大。故礦化對力學(xué)性能的提升有一定作用。

圖7 力學(xué)性能對比Fig. 7 Comparison of mechanical properties

3 結(jié)論

本研究利用編織手段，制備了“12×12”結(jié)構(gòu)的人工韌帶，并進(jìn)行脫膠處理得到基于絲素纖維的人工韌帶，同時利用不同濃度的絲素蛋白、海藻酸鈉及不同比例的絲素蛋白/海藻酸鈉混合材料對人工韌帶進(jìn)行涂層處理。將處理后的樣品采取體外礦化，通過對固體沉積物的表征，探究了SA、SF 的最佳濃度參數(shù)及復(fù)合溶液的最優(yōu)比例。得到結(jié)論如下：

（1）脫膠后雖力學(xué)性能有所下降，但整體力學(xué)性能仍滿足天然力學(xué)性能特性。同時經(jīng)涂層改性可恢復(fù)力學(xué)性能的損失，礦化可優(yōu)化其力學(xué)性能，故該人工韌帶為可替換材料。

（2）試驗表明，SF、SA、SF/SA 涂層對纖維均有包覆感，且3 種不同濃度涂層改性后的人工韌帶形貌無明顯差異，但SF、SA 濃度為1%時，沉積物較為均勻，因此復(fù)合涂層質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇1%的SA 和SF 比較合適。

（3）當(dāng)SFAL-SF：SA=5：5 時，沉積物粒徑更小且分布更均勻，此時得到的人工韌帶性能也最佳。

（4）固體表面Zeta 電位測試結(jié)果表明，所有樣品都帶負(fù)電荷，且絲素蛋白在堿性條件下更容易產(chǎn)生負(fù)電荷。