黃芪甲苷在心肌梗死大鼠模型中的心肌保護(hù)作用

李夢(mèng)華

(南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校， 南陽(yáng) 473061)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展及人口老齡化加速，近些年來(lái)中國(guó)心血管疾病患病率逐年攀升，國(guó)家心血管病中心發(fā)布的《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》中指出，近3億心血管病患者人群中多半因心肌梗死引發(fā)死亡，致死率排在各病種第一位，成為制約中國(guó)公共衛(wèi)生發(fā)展的主要問(wèn)題之一[1]。心肌梗死(myocardial infarction,MI)的防治主要措施是對(duì)缺血心肌恢復(fù)再灌注，臨床主要采取溶栓藥物和手術(shù)治療[2-3]。不足的是，心肌細(xì)胞缺血后死亡以每小時(shí)20%速度發(fā)生，而院外MI患者能在120 min黃金救治時(shí)間內(nèi)進(jìn)行手術(shù)介入的并不多，此外，溶栓藥物副作用較大，如凝血機(jī)制改變后容易引發(fā)體內(nèi)出血等。若能在心肌出現(xiàn)缺血缺氧時(shí)通過(guò)藥物干預(yù)，重建結(jié)構(gòu)和功能完備的側(cè)支循環(huán)，修復(fù)心肌細(xì)胞損傷，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)心肌的“自我搭橋”，成為眾多學(xué)者研究關(guān)注的焦點(diǎn)，在此背景下，治療性血管新生作為一種新的策略被提出，并在短期內(nèi)取得了一定的研究進(jìn)展[4-5]。

依據(jù)臨床癥候的相似性，心肌梗死常歸屬于中醫(yī)學(xué)“真心痛”“胸痹”等范疇診治，中醫(yī)認(rèn)為“痛則不通，通則不痛”，治療中尤其注重益氣活血、通絡(luò)止痛。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載黃芪“可治一切氣血虛弱之證”，是中醫(yī)臨床治療此類疾病的首選中藥。團(tuán)隊(duì)在前階段實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)黃芪提取物(黃芪總苷)可有效提升離體大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物活性，促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)生遷移和黏附，提示黃芪提取物可促進(jìn)微血管的再生[6]。中藥黃芪的主要功能成分黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)，化學(xué)式為C41H68O14，具有抗炎、抗纖維化、改善脂質(zhì)代謝、促進(jìn)傷口愈合等多種功效[7]?，F(xiàn)在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察AS-IV在MI大鼠模型中對(duì)心肌功能和血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD(Sprague Dawley)雄性大鼠24只，10周齡，體重(200±20) g，[北京均可生物工程有限公司，合格證：SCXK(京)2017—0002]。12 h明暗交替循環(huán)，置于單獨(dú)通風(fēng)的籠子中，自由進(jìn)食進(jìn)水，室溫(25±1) ℃，濕度(54±6)%，環(huán)境噪聲小于45 dB。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》并經(jīng)南陽(yáng)理工學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：NYISTEEC—2017026)。

1.2 建立MI大鼠模型

模型復(fù)制采用團(tuán)隊(duì)在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目中使用的心肌梗死大鼠造模方法[8]。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后固定頭部和四肢，動(dòng)物呼吸機(jī)維持。心前區(qū)備皮消毒后，于胸骨左緣心尖搏動(dòng)處切開(kāi)，依次剪開(kāi)分離，在左前降支處結(jié)扎1 min，肉眼可見(jiàn)心室處顏色變淺，心電圖顯示Ⅱ?qū)?lián)QRS波增寬、ST段弓背抬高，MI大鼠模型復(fù)制成功。假手術(shù)組開(kāi)胸后不結(jié)扎。為預(yù)防術(shù)后感染，連續(xù)3天灌胃給藥氨卞青霉素。

1.3 分組及用藥

實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)等分假手術(shù)對(duì)照組(Sham組，等量生理鹽水)、AS-IV組[40 mg/(kg·d)]和模型組(MI組，等量生理鹽水)各8只，均采用尾靜脈注射藥物，連續(xù)4周。

1.4 超聲心動(dòng)圖測(cè)量

藥物干預(yù)4周后，1.5%異氟烷麻醉MI大鼠，小動(dòng)物超聲成像儀(Vevo 3100，VisualSonics，Canda)檢測(cè)大鼠心臟，采用30 MHz中頻掃描頭的超聲系統(tǒng)評(píng)估心臟結(jié)構(gòu)和功能。測(cè)量大鼠心臟功能指標(biāo)：左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室收縮期內(nèi)徑(left ventricular internal systolic diameter,LVIDs)、左室舒張期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

MI大鼠脫臼處死，冰臺(tái)操作摘取心臟后磷酸鹽緩沖液清洗，固定于4%多聚甲醛。酒精分梯度濃度組織脫水后進(jìn)行包埋，調(diào)整厚度5 μm組織切片。依據(jù)操作步驟說(shuō)明，使用Masson染色檢測(cè)試劑盒(H3208，南京信帆生物技術(shù)科技有限公司)進(jìn)行染色，測(cè)量MI大鼠心肌的纖維化程度。為了評(píng)估血管密度，進(jìn)行CD31在心肌梗死邊界區(qū)域肉芽組織中的免疫染色(GB12063，武漢谷歌生物科技有限公司)。通過(guò)光學(xué)顯微鏡(DMIL-RF1，Leica,Germany)放大400倍，使用Image Pro Plus圖像軟件進(jìn)行測(cè)算分析。

1.6 TUNEL檢測(cè)

MI大鼠心肌取材、4%多聚甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋切片參照1.5節(jié)進(jìn)行。通過(guò)TUNEL試劑盒(貨號(hào)：FY600017，上海富源生物科技有限公司)依據(jù)操作步驟說(shuō)明，心肌切片采用DAPI溶液染色評(píng)估細(xì)胞核形態(tài)，顯微鏡下放大400倍對(duì)標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行成像，在梗死邊緣區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡總數(shù)。

1.7 Western blot檢測(cè)

采用RIPA裂解液溶解MI大鼠心肌組織，4oC下14 000 r/min的速度離心5 min，吸取上清液，依據(jù)蛋白檢測(cè)試劑盒操作步驟檢測(cè)蛋白含量。將蛋白溶解后依次電泳分離、轉(zhuǎn)移至膜上，加入一抗稀釋液(1∶1 000)在35 ℃下孵育1 h，包括:原發(fā)性抗體GAPDH(貨號(hào)：A10025武漢艾美捷生物科技公司)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)(貨號(hào)：Y1169、Y1175，上海巴士德生物科技有限公司)、堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(貨號(hào)：AK015，北京銀泰生物科技有限公司)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,AKT)和磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p-AKT)(貨號(hào)：ybP004、ybP001,上海巴士德生物科技有限公司)、半胱天冬氨酶-3(Caspase-3)(貨號(hào)：AC031武漢艾美捷生物科技公司)洗膜后加入二抗(1∶1 000)稀釋液在35 ℃下孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑使免疫反應(yīng)條帶可視化，通過(guò)光密度測(cè)定法進(jìn)行定量。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 AS-IV對(duì)MI大鼠心功能的影響

MI大鼠模型經(jīng)過(guò)AS-IV干預(yù)4周后，采用超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)測(cè)量各組大鼠心功能指標(biāo)。模型組與假手術(shù)對(duì)照組相比，心功能LVFE與LVFS指標(biāo)測(cè)定明顯降低，提示心臟射血受阻，而LVIDs與LVIDd指標(biāo)明顯升高(P<0.01)，進(jìn)一步說(shuō)明心肌增厚心功能受損。而AS-IV組與模型組相比較，心功能LVFS與LVFE指標(biāo)明顯回升，LVIDs與LVIDd指標(biāo)有所下降(P<0.05)。表明AS-IV可提升MI大鼠心肌收縮能力和左心室射血功能，對(duì)大鼠心功能改善有積極作用。如表1所示。

表1 各組心功能指標(biāo)Table 1 Cardiac function indexes of each group

2.2 心肌纖維化觀察

經(jīng)過(guò)Masson染色后的MI大鼠心肌圖片顯示，假手術(shù)對(duì)照組明顯看出紅色的心肌組織清晰規(guī)則，架構(gòu)整齊，血管腔壁完整；模型組紅色心肌排列紊亂，其中壞死心肌由藍(lán)色膠原纖維取代，血管出現(xiàn)破碎；AS-IV組紅色心肌較模型組占比高，藍(lán)色膠原纖維相比較少，血管形態(tài)較清晰。這些現(xiàn)象表明，AS-IV可降低心肌組織的纖維化程度。如圖1所示。

*表示與假手術(shù)對(duì)照組相比，P<0.01；**表示與模型組相比，P<0.05

2.3 毛細(xì)血管密度觀察

通過(guò)抗CD31免疫組織化學(xué)染色計(jì)算每個(gè)視野的毛細(xì)血管密度來(lái)確定AS-IV治療對(duì)MI大鼠心肌血管發(fā)生水平的作用。假手術(shù)對(duì)照組和模型組對(duì)比，毛細(xì)血管密度未觀察到顯著差異，AS-IV組經(jīng)治療后與模型組相比，毛細(xì)血管密度顯著增加。表明AS-IV可通過(guò)增加心肌梗死后毛細(xì)血管密度促進(jìn)血管生成(P<0.05)。如圖2所示。

*表示與模型組相比，P<0.05

2.4 心肌細(xì)胞凋亡觀察

使用TUNEL染色法在手術(shù)后4周評(píng)估AS-IV對(duì)缺血后心肌存活率的作用。觀察發(fā)現(xiàn)，DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)復(fù)染后細(xì)胞核顯現(xiàn)藍(lán)色，模型組與假手術(shù)對(duì)照組相比，凋亡心肌細(xì)胞的比例明顯上升(P<0.05)，與模型組相比，經(jīng)過(guò)AS-IV干預(yù)后，凋亡的心肌細(xì)胞所占比例有所下降(P<0.05)。Western蛋白印跡表達(dá)檢測(cè)顯示，模型組與假手術(shù)對(duì)照組相比，p-AKT蛋白表達(dá)降低顯著(P<0.05)，而AS-IV組較MI組p-AKT水平有所提升(P<0.05)；Caspase-3的表達(dá)在MI組顯著增加，通過(guò)AS-IV干預(yù)后明顯減少。如圖3、圖4所示。

*表示與假手術(shù)對(duì)照組相比，P<0.01；**表示與模型組相比，P<0.05

*表示與假手術(shù)對(duì)照組相比，P<0.01；**表示與模型組相比，P<0.05

2.5 VEGF、VEGFR-2和bFGF的表達(dá)

Western蛋白印跡表達(dá)檢測(cè)三組大鼠心肌組織中VEGF、VEGFR-2與bFGF蛋白的定量，模型組與假手術(shù)對(duì)照組相比，參與血管生成因子VEGF，VEGFR-2與bFGF蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，AS-IV組與模型組相比，VEGF、VEGFR-2和bFGF蛋白水平顯著提升(P<0.05)。提示AS-IV可加強(qiáng)血管再生的信號(hào)通路傳導(dǎo)。如圖5所示。

*表示與假手術(shù)對(duì)照組相比，P<0.01；**表示與模型組相比，P<0.05

3 討論

心肌缺血缺氧后導(dǎo)致不可逆的心肌組織壞死，產(chǎn)生大量的膠原纖維和增生的結(jié)締組織，嚴(yán)重?fù)p害心臟的正常生理功能。本次研究經(jīng)Masson染色和TUNEL染色證實(shí)，心肌梗死模型大鼠的心肌組織受損嚴(yán)重，凋亡細(xì)胞增加，膠原纖維增多，血管腔不完整，阻礙了心肌組織的血管新生，這次結(jié)果與團(tuán)隊(duì)組之前研究結(jié)果[9]相一致。治療性血管新生是促進(jìn)側(cè)支循環(huán)建立的一種新的治療思路，在改善缺血區(qū)域功能，恢復(fù)循環(huán)灌注具有積極的作用，目前主要方法有基因療法、細(xì)胞療法、生長(zhǎng)因子療法等，但因存在未知問(wèn)題較多，經(jīng)濟(jì)要求較高，并不具備普適性。中醫(yī)藥治療心血管疾病歷史悠久，效果顯著，中醫(yī)認(rèn)為心肌梗死主要發(fā)病機(jī)制是“氣虛血瘀”，氣行則血脈通暢，氣滯則血行無(wú)力，易致瘀閉。因此治療此類疾病，常選具有“補(bǔ)氣升陽(yáng)、拖毒生肌”功效的黃芪作為君藥?？梢?jiàn)，中醫(yī)理論的“祛瘀生新”和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“治療性血管新生”具有相同的契合之處。

黃芪甲苷是中國(guó)《藥典》中判斷黃芪優(yōu)劣的常用檢測(cè)指標(biāo)。通過(guò)采用SD大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎的造模方法，心電圖檢查成功復(fù)制MI模型，超聲探測(cè)顯示SD大鼠心功能明顯下降，心肌增厚，心肌收縮力降低。經(jīng)過(guò)4周的AS-IV干預(yù)，大鼠左心室收縮功能明顯好轉(zhuǎn)，這是對(duì)中醫(yī)理論“氣主推動(dòng)，氣能行血”的有力說(shuō)明。完整的細(xì)胞形態(tài)和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，是恢復(fù)灌注的新生血管重要的形態(tài)學(xué)特征[10]。經(jīng)過(guò)Masson和CD31染色后顯示AS-IV組大鼠心肌組織中新生的毛細(xì)血管密度明顯增多，且血管腔的形態(tài)完整，層次清晰，紅色心肌細(xì)胞所占比例較高，排列規(guī)則，從組織形態(tài)學(xué)顯示黃芪甲苷對(duì)促進(jìn)心肌梗死周邊的毛細(xì)血管新生有著積極的作用。血管生成包括血管的形成和維持，多種信號(hào)分子參與血管生成的調(diào)節(jié)，最重要的就是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，它對(duì)生理和病理血管生成都是必不可少的。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)包括VEGFR-1、-2和-3共3個(gè)家族成員，其中VEGFR-2位于內(nèi)皮細(xì)胞上，所有的VEGF-A亞型都含有能與VEGFR-2結(jié)合并具有相同親和力的殘基，是VEGF-A的主要信號(hào)靶受體，參與到人體的生長(zhǎng)發(fā)育以及各階段的生理與病理過(guò)程。VEGF主要通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞上VEGFR-2介導(dǎo)激活下游通路發(fā)揮生物學(xué)作用，加速分化血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加了內(nèi)皮細(xì)胞存活率。促進(jìn)造血干細(xì)胞再生等，在細(xì)胞分裂和重組的作用中最強(qiáng)[11]。VEGF-A激活受體VEGFR-2信號(hào)通路后，喚醒了下游通路因子儲(chǔ)存在細(xì)胞質(zhì)中的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)，PI3K通過(guò)第二信使改變了靜息電位下的AKT結(jié)構(gòu)并全面激活A(yù)KT通路，AKT從細(xì)胞膜中釋放，傳遞生物信號(hào)到細(xì)胞質(zhì)中,參與調(diào)控細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)錄[12]。Caspase-3是AKT的下游分子之一，活化后的Caspase-3可以裂解DNA引起細(xì)胞死亡。AKT可以磷酸化Caspase-3的活性，降低生物效應(yīng)，引起系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，控制減少細(xì)胞凋亡[13]。bFGF是一種肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，是胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基的首要構(gòu)成成分，同樣作為有效的血管生成因子，參與血管生成和肉芽組織形成的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，主要參與介導(dǎo)PI3K/AKT細(xì)胞通路發(fā)揮作用[14]。經(jīng)過(guò)Western免疫印跡法檢測(cè)證實(shí)，模型組心肌缺血缺氧抑制了VEGF、VEGFR-2、bFGF、AKT蛋白的表達(dá)，出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡、毛細(xì)血管破裂以及心肌纖維化增多等不良情況，而AS-IV組中VEGF、VEGFR-2和bFGF的表達(dá)有所增加，通過(guò)促進(jìn)MI后的心臟血管生成進(jìn)而保護(hù)心臟功能。此外，AS-IV上調(diào)了AKT表達(dá)，并抑制Caspase-3活性，有效減少了心肌細(xì)胞凋亡。提示AS-IV治療可減輕缺血缺氧對(duì)心肌細(xì)胞帶來(lái)的損傷，增強(qiáng)心肌的收縮功能，增加心肌損傷后的血管新生能力，對(duì)恢復(fù)再灌注循環(huán)具有重要作用。

4 結(jié)論

綜上所述，主要探討了黃芪甲苷對(duì)心臟功能和心肌梗死后組織病理學(xué)變化的影響，得到如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

(1)黃芪甲苷對(duì)MI大鼠的心肌功能有益。

(2)黃芪甲苷可減輕MI后心肌的纖維化程度并減少心肌細(xì)胞凋亡。

(3)黃芪甲苷可通過(guò)上調(diào)VEGF和bFGF的表達(dá)促進(jìn)血管生成。

在本此研究中，初步明確了黃芪甲苷的促血管生成效應(yīng)，對(duì)拓展中藥黃芪防治缺血性心臟病提供了實(shí)驗(yàn)支持。