不同消毒劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦育苗水質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)的影響

張文偉，黃 忠 ，段亞飛，林黑著 ，江世貴，黃建華

（1. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300； 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地，廣東 深圳 518121）

自2000年以來(lái)，隨著凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei) 的引入、推廣和普及，中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要支柱產(chǎn)業(yè)。近年來(lái)，近海水域環(huán)境生態(tài)失衡、富營(yíng)養(yǎng)化、赤潮頻發(fā)、病害滋生給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)巨大損失。環(huán)境微生物和養(yǎng)殖生物之間的相互作用受到越來(lái)越多的關(guān)注[1-2]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，微生物菌群在水環(huán)境物質(zhì)轉(zhuǎn)化以及養(yǎng)殖動(dòng)物健康、營(yíng)養(yǎng)吸收、病原防御過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3-4]。關(guān)于養(yǎng)殖對(duì)蝦腸道微生物和養(yǎng)殖環(huán)境的關(guān)系已有較多的研究報(bào)道，如發(fā)病對(duì)蝦和健康對(duì)蝦腸道微生物與養(yǎng)殖環(huán)境微生物之間的關(guān)系[5-9]。而有關(guān)對(duì)蝦早期發(fā)育階段的幼體微生物和育苗水環(huán)境微生物之間的互作關(guān)系，以及對(duì)幼苗期與養(yǎng)成期對(duì)蝦體內(nèi)微生物的相關(guān)性研究相對(duì)較少。

對(duì)蝦幼體發(fā)育對(duì)水環(huán)境質(zhì)量要求非常高。近海水環(huán)境的富營(yíng)養(yǎng)化、有害細(xì)菌及其耐藥性的加重，使對(duì)蝦育苗病害增多，苗種生產(chǎn)難度增大。海水凈化處理已成為對(duì)蝦育苗生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，直接影響育苗生產(chǎn)的成敗[10]。傳統(tǒng)水處理方法主要采用物理過(guò)濾和化學(xué)消毒以降低或消除水環(huán)境中的有毒有害物質(zhì)。邢詒炫等[10]報(bào)道砂濾對(duì)海水中細(xì)菌的去除率為80%～90%，多級(jí)砂濾與一級(jí)砂濾對(duì)細(xì)菌的去除率并無(wú)顯著差異。因此，絕大多數(shù)育苗場(chǎng)會(huì)再使用含氯或其他化學(xué)消毒劑對(duì)對(duì)蝦育苗用水進(jìn)行消毒殺菌處理。水產(chǎn)消毒劑主要有醛類 [ 甲醛 (HCHO)、戊二醛 (C5H8O2)]、季銨鹽類和鹵素類 (含氯、溴、碘)。研究表明，0.5 mg·L?1有效氯可殺死總菌量的96.1%，1 mg·L?1有效氯可殺死99.1%的細(xì)菌[11]。19 mg·L?1甲醛在短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)菌有一定的殺滅、抑制作用，但并不能長(zhǎng)效控制育苗水體細(xì)菌總數(shù)[10]。二氧化氯 (ClO2)和碘制劑對(duì)細(xì)菌及芽孢、病毒、真菌等微生物有強(qiáng)大的殺滅作用，且不產(chǎn)生抗藥性，是一種低毒、廣譜殺菌消毒藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和育苗中廣泛應(yīng)用[12]。

近年來(lái)，育苗用水的處理工藝越來(lái)越復(fù)雜化，往往采用物理 (沉淀、過(guò)濾) -化學(xué) (消毒) -物理 (紫外殺菌) 等多個(gè)復(fù)雜處理工藝來(lái)提升育苗水質(zhì)，而這些處理對(duì)育苗水環(huán)境微生物菌群的影響，以及后續(xù)對(duì)幼體發(fā)育及其體內(nèi)菌群的影響尚不清楚；此外，幼體不同發(fā)育階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求和攝食習(xí)性的不同，也可能影響幼體及其水環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)。因此，本研究采用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法和細(xì)菌16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)，研究了碘 (I2)、二氧化氯、甲醛溶液和漂白粉 [Ca(ClO)2] 4種常用消毒劑對(duì)對(duì)蝦育苗水質(zhì)、水環(huán)境和對(duì)蝦幼體腸道微生物菌群的影響及育苗效果，以期為凡納濱對(duì)蝦育苗水體消毒處理及其菌群調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)蝦育苗實(shí)驗(yàn)和樣品采集

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)海水先經(jīng)砂濾和沉淀，再通過(guò)300目以上的棉布濾袋過(guò)濾后進(jìn)入500 L的玻璃鋼實(shí)驗(yàn)桶，實(shí)際育苗水體為400 L。實(shí)驗(yàn)共分為5組，即對(duì)照組、碘組、二氧化氯組、甲醛組和漂白粉組，每組3個(gè)平行，使用劑量參照育苗生產(chǎn)推薦濃度和參考文獻(xiàn)[10–12]。對(duì)照組水體不用消毒劑處理；碘組水體使用1 mg·L?1碘消毒；二氧化氯組水體使用3 mg·L?1二氧化氯消毒；甲醛組水體使用25 mL·m?3甲醛溶液消毒；漂白粉組水體使用30 mg·L?1漂白粉消毒。各組水體經(jīng)消毒和曝氣處理48 h后，投入凡納濱對(duì)蝦無(wú)節(jié)幼體 (購(gòu)自深圳環(huán)球生物科技有限公司)，幼體初始密度為200尾·L?1。實(shí)驗(yàn)期間，無(wú)節(jié)幼體 (N6)或溞狀幼體(Z1)期幼體開(kāi)始喂食螺旋藻粉和蝦片，并逐步增加蝦元、BP、黑粒等富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和礦物質(zhì)的人工配合飼料。各桶育苗水體連續(xù)曝氣，無(wú)水交換，不使用抗生素和其他化學(xué)藥物。海水鹽度 30，pH 8.0～8.2，溫度 (30±0.5) ℃，溶解氧質(zhì)量濃度6.0 mg·L?1以上，均能滿足對(duì)蝦幼體發(fā)育需求。

每天取少量幼體用顯微鏡觀察確認(rèn)發(fā)育情況，并計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)發(fā)育期的成活率。在不同消毒劑處理0、48、96 h后，每組取1 L 水體，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾膜于無(wú)菌凍存管中； 在N6、Z1、糠蝦幼體 (M1) 和仔蝦 (P1) 等關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶隨機(jī)采集1 L育苗水體，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾膜于無(wú)菌凍存管中；此外，使用40目篩絹撈網(wǎng)從每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶中取幼體1 g，先用干凈過(guò)濾海水沖洗，再用75%乙醇對(duì)幼體進(jìn)行體表消毒，最后用無(wú)菌海水沖洗3次置于無(wú)菌凍存管中。所得濾膜和幼體均于?80 °C保存，用于微生物菌群分析。

1.2 細(xì)菌測(cè)定方法

在不同消毒劑處理后24和72 h，各實(shí)驗(yàn)組采集10 mL海水，在N6—P1和P5幼體不同發(fā)育時(shí)期，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)桶隨機(jī)采集10 mL育苗水體，取0.5 mL，用無(wú)菌海水按10、100、1 000倍數(shù)進(jìn)行稀釋，然后取0.1 mL稀釋水樣滴入到已經(jīng)制備好的2216E和TCBS (Thiosulfate citrate bilesaccharose)培養(yǎng)基上，用滅菌玻璃棒將水樣涂抹均勻至完全被培養(yǎng)基吸收，28 ℃恒溫培養(yǎng)，于72 h 后采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算弧菌和異養(yǎng)菌數(shù)量。計(jì)數(shù)時(shí)選取菌落數(shù)30～300之前的平板，每個(gè)稀釋度取3個(gè)平行樣結(jié)果的平均值。

1.3 細(xì)菌總DNA提取及群落結(jié)構(gòu)分析

使用DNA提取試劑盒 (Mo Bio Laboratories,Inc., Carlsbad, CA) 抽提水體濾膜和幼體微生物菌群DNA，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA質(zhì)量。采用正向引物 (CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT) 和反向引物 (GGACTACNVGGGTWTCTAATCC) 對(duì)細(xì)菌16S rDNA基因的V3—V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共20 μL，包含模板 DNA 20 ng、5×FastPfu buffer 4 μL、2.5 mmol·L?1dNTPs 2 μL、5 μmol·L?1正反向引物各0.8 μL、FastPfu 聚合酶 0.4 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至總體積20 μL。使用MetaVx?文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，并且通過(guò)Qubit 2.0 Fluorometer檢測(cè)文庫(kù)濃度。DNA文庫(kù)混合后，在Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行PE300雙端測(cè)序。所得序列經(jīng)過(guò)質(zhì)控、組裝后，使用16S rRNA參考數(shù)據(jù)庫(kù)Silva 123進(jìn)行比對(duì)；然后使用QIIME軟件 (1.9.1) 基于RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對(duì)OTU的代表性序列進(jìn)行物種分類學(xué)注釋，并在屬分類水平上分析各組菌群的組成差異。菌群高通量測(cè)序分析委托廣州吉瑞基因有限公司完成。

1.4 氨氮與亞硝酸氮質(zhì)量濃度的測(cè)定

每個(gè)平行組每天取300 mL育苗水體，經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾后，用于氨氮與亞硝酸氮質(zhì)量濃度測(cè)定，分別采用《海洋調(diào)查規(guī)范》 (GB/T 12763.4—2007) 中的溴酸鈉氧化法和重氮-偶氮光度法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 水體氨氮和亞硝酸鹽質(zhì)量濃度變化

使用消毒劑前測(cè)定二級(jí)過(guò)濾海水中的氨氮質(zhì)量濃度為0.005 mg·L?1，使用不同消毒劑消毒24 h后測(cè)定為 0.003～0.006 mg·L?1，不同實(shí)驗(yàn)組間沒(méi)有顯著差異 (P＞0.05)。溞狀幼體 (Z1—Z3) 發(fā)育階段，各組水體氨氮質(zhì)量濃度迅速上升，其中對(duì)照組顯著高于各消毒處理組 (P＜0.05)?？肺r幼體 (M1—M3) 以后，除漂白粉組的氨氮質(zhì)量濃度有所下降外，對(duì)照組和其他消毒劑處理組氨氮質(zhì)量濃度均在0.10 mg·L?1水平波動(dòng)，最高組的氨氮質(zhì)量濃度為0.115 mg·L?1(圖 1-a)。

使用消毒劑前測(cè)定過(guò)濾海水中的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為0.005 mg·L?1，使用不同消毒劑消毒24 h后測(cè)定為 0.003～0.006 mg·L?1，不同實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差異 (P＞0.05)。Z2期之前，各組水體亞硝酸鹽質(zhì)量濃度迅速上升，之后呈緩慢上升趨勢(shì)。M3期之前，對(duì)照組、碘組和二氧化氯組的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度顯著高于甲醛組和漂白粉組。整個(gè)育苗期間，漂白粉組的亞硝酸鹽質(zhì)量濃度均為最低，而對(duì)照組亞硝酸鹽質(zhì)量濃度最高，P5期升到最高值0.065 mg·L?1(圖 1-b)。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組中水體氨氮和亞硝酸氮質(zhì)量濃度變化Figure 1 Change in mass concentrations of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in water in different groups

2.2 水體總菌和弧菌數(shù)量變化

使用消毒劑前測(cè)定二級(jí)過(guò)濾海水中的總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量為2.88×105CFU·mL?1，使用不同消毒劑消毒24和72 h [ 無(wú)節(jié)幼體 (N) 期]后，測(cè)定各組水體中總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量和滅菌效率見(jiàn)表1。甲醛對(duì)海水中細(xì)菌殺滅最為有效，第24和第72小時(shí)滅菌效率分別為94.62%和84.46%；二氧化氯次之，分別為89.24%和68.66%；碘和漂白粉在第24小時(shí)滅菌效率分別為74.65%和48.96%，但第72小時(shí)兩組細(xì)菌總數(shù)與對(duì)照組接近。One-way ANOVA分析結(jié)果表明，甲醛組和二氧化氯組第24與第72小時(shí)細(xì)菌總數(shù)顯著低于碘組、漂白粉組和對(duì)照組。

表1 不同消毒劑組育苗海水處理24與72 h (無(wú)節(jié)幼體期) 水體中總異養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量及滅菌效率Table 1 Number of heterotrophic bacteria and sterilization efficiency in seawater treated with different disinfectant groups for 24 h and 72 h (N stage)

隨著幼體生長(zhǎng)發(fā)育，各組水體總菌數(shù)量均不斷升高 (圖2-a)。其中，幼體在Z2期之前，甲醛組和二氧化氯組的總菌數(shù)量顯著低于碘組、漂白粉組和對(duì)照組 (P＜0.05)，隨后甲醛組和二氧化氯組總菌數(shù)量明顯升高；P5幼體期，漂白粉組和甲醛組的總菌數(shù)顯著高于其他3組 (P＜0.05)。

幼體在Z2期之前，甲醛組和二氧化氯組的弧菌數(shù)量顯著低于碘組、漂白粉組和對(duì)照組 (P＜0.05)；幼體在M2期之前，弧菌數(shù)量一直維持較低水平，之后隨著其發(fā)育生長(zhǎng)，各組弧菌數(shù)量急劇上升。P5幼體期，碘組和二氧化氯組弧菌數(shù)量顯著高于漂白粉組、對(duì)照組和甲醛組 (P＜0.05，圖2-b)。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組中水體總菌和弧菌數(shù)量變化Figure 2 Changes of total aquatic bacteria and Vibrio in different groups

2.3 水體和幼體菌群結(jié)構(gòu)分析

使用不同消毒劑0、48、96 h后各組水體屬水平菌群組成相對(duì)豐度見(jiàn)圖3。使用不同消毒劑0 h后，對(duì)照組初始水體主要優(yōu)勢(shì)菌屬為東吉科拉屬(Donghicola) 和紅桿菌屬 (Rhodobacteraceae)，分別占43.2%和25.5%；二氧化氯組為紅桿菌屬和Nautella，分別占38.4%和9.3%；碘組為紅桿菌屬、東吉科拉屬和Nautella，分別占27.4%、7.4%和5.8%；甲醛組為假交替單胞菌屬 (Pseudoalteromonas)、交替單胞菌屬 (Alteromonas) 和嗜甲基菌屬 (Methylophaga)，分別占43.6%、34.3%和5.0%；漂白粉組為嗜甲基菌屬和假交替單胞菌屬，分別占83.4%和4.0%。使用消毒劑48 h后，對(duì)照組初始水體主要優(yōu)勢(shì)菌屬為東吉科拉屬和紅桿菌屬，分別占23.3%和20.9%；二氧化氯組為紅桿菌屬、黃桿菌科未能培養(yǎng)屬和東吉科拉屬，分別占比18.0%、8.4%和8.4%；碘組為紅桿菌屬、Thalassococcus、海命菌屬 (Marivita) 和東吉科拉屬，分別占比41.8%、10.7%、7.4%和7.3%；甲醛組為嗜甲基菌屬、Mesoflavibacter、假交替單胞菌屬和東吉科拉屬，分別占比84.0%、3.7%、2.7%和2.0%；漂白粉組為交替單胞菌屬、Leisingera、Nautella和鹽單胞菌屬 (Halomonas)，分別占比44.0%、20.9%、12.9%和12.2%。使用消毒劑96 h后，對(duì)照組初始水體主要優(yōu)勢(shì)菌屬為東吉科拉屬、紅桿菌屬和Gammaproteobacteria incertae sedis_unclassified，分別占27.1%、15.5%和5.5%；二氧化氯組為紅桿菌屬、Gammaproteobacteria incertae sedis_unclassified和東吉科拉屬，分別占比30.2%、10.9%和8.7%；碘組為紅桿菌屬、軍團(tuán)菌屬 (Legionella)、東吉科拉屬、嗜甲基菌屬、Thalassococcus和海命菌屬，分別占比38.2%、13.5%、6.2%、5.4%、3.2%和3.1%；甲醛組為L(zhǎng)eisingera、Tropicibacter、嗜甲基菌屬、Mesoflavibacter和東吉科拉屬，分別占比29.6%、23.3%、8.0%、5.9%和4.0%；漂白粉組為L(zhǎng)eisingera、Thalassococcus、Nautella、嗜甲基菌屬、紅桿菌屬、黃桿菌屬 (Tenacibaculum)、交替單胞菌屬和鹽單胞菌屬，分別占比24.9%、17.1%、10.2%、9.6%、6.9%、6.2%、5.5%和3.0%。

圖3 不同消毒劑0、48和96 h后各組水體屬水平菌群組成相對(duì)豐度Figure 3 Relative abundance of microbial community of hatchery water after 0 h, 48 h and 96 h of different disinfectants groups at genus level

在幼體各發(fā)育階段，從育苗水體和對(duì)蝦幼體中共鑒定出237個(gè)菌屬，其中水體優(yōu)勢(shì)菌屬有50種，而幼體優(yōu)勢(shì)菌屬有33種。不同處理組不同發(fā)育期育苗水體的主要優(yōu)勢(shì)菌屬差異很大，尤其是N6期和Z1期細(xì)菌屬種類多，差異大 (圖4)。N6期育苗水體中主要優(yōu)勢(shì)菌屬為OM43_clade、食烷菌屬(Alcanivorax)、AEGEAN-169_marine_group、岸生菌屬 (Litoricola)、Porticoccus、赤桿菌屬 (Erythrobacter)、交替赤桿菌屬 (Altererythrobacter)、Lutimaribacter、黃桿菌屬、Coxiella、水棲菌屬 (Enhydrobacter)、Muricauda、Phaeodactylibacter、NS3a_marine_group、Salinihabitans、嗜甲基菌屬和泥灘微菌屬 (Gilvibacter)。與N6期比Z1期育苗水體中增加了東吉科拉屬、紅菌屬 (Rhodobium)、嗜冷桿菌屬 (Psychrobacter)、動(dòng)性桿菌屬 (Planomicrobium)、念株菌屬 (Candidatus-Aquiluna) 和埃希氏桿菌屬 (Escherichia-Shigella) 幾種優(yōu)勢(shì)菌屬。隨著幼體發(fā)育，M1和P1期不同處理組優(yōu)勢(shì)菌屬種類基本一致，但不同菌的豐度存在差異。M1期育苗水體中主要優(yōu)勢(shì)菌屬為東吉科拉屬、黏著桿菌屬(Cohaesibacter)、Phaeodactylibacter、海命菌屬、Maritalea、魯杰氏菌屬 (Ruegeria)、Winogradskyella和念株菌屬，而P1期育苗水體中主要優(yōu)勢(shì)菌屬為弧菌屬 (Vibrio)、念株菌屬、NS3a_marine_group、海命菌屬、食烷菌屬、假交替單胞菌屬、OM43_clade、Marinomonas、Aureimarina、嗜冷桿菌屬、黏著桿菌屬和Phaeodactylibacter。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組育苗水體屬水平菌群組成相對(duì)豐度Figure 4 Relative abundance of microbial community of hatchery water in different groups at genus level

隨著幼體生長(zhǎng)發(fā)育，不同時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌屬變化較大，主要為弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬 (Acinetobacter) 、動(dòng)性桿菌屬、微桿菌屬 (Exiguobacterium) 、嗜冷桿菌屬、嗜甲基菌屬和魯杰氏菌屬 (圖5)。其中，N6期幼體不同組間優(yōu)勢(shì)菌屬差異較大，埃希氏桿菌屬和鹽單胞菌屬是二氧化氯組主要優(yōu)勢(shì)菌屬，Blastomonas、Gemmatirosa和埃希氏桿菌屬是漂白粉組主要優(yōu)勢(shì)菌屬，嗜甲基菌屬、埃希氏桿菌屬、嗜冷桿菌屬和魯杰氏菌屬是甲醛組主要優(yōu)勢(shì)菌屬。Z1期幼體主要優(yōu)勢(shì)菌屬為動(dòng)性桿菌屬、微桿菌屬、嗜冷桿菌屬；M1期各組幼體最占優(yōu)勢(shì)屬是弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬、微桿菌屬；P1期幼體內(nèi)較為優(yōu)勢(shì)屬為魯杰氏菌屬、埃希氏桿菌屬、黏著桿菌屬和弧菌屬。

圖5 不同實(shí)驗(yàn)組幼體屬水平菌群組成相對(duì)豐度Figure 5 Relative abundance of microbial community of larvae in different groups at genus level

2.4 幼體成活率

在幼體各發(fā)育階段，甲醛組均有較高的成活率，其中Z1—Z3期成活率接近90%，P5期最終成活率為44.44%，顯著高于其他組 (P＜0.05)；其次是漂白粉組，成活率高于對(duì)照、碘和二氧化氯組，但無(wú)顯著差異 (P＞0.05，圖6)。

圖6 不同實(shí)驗(yàn)組幼體不同時(shí)期的成活率Figure 6 Survival rates of L. vannamei larvae at different developmental stages

3 討論

3.1 消毒劑對(duì)育苗水體細(xì)菌、水質(zhì)及幼體成活率的影響

消毒劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)揮著重要作用，能凈化和穩(wěn)定水質(zhì)，維護(hù)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物良好的生長(zhǎng)環(huán)境，殺滅或消除環(huán)境病原微生物，防止疾病的發(fā)生[12]。本研究中，不同消毒劑殺菌效果不同，對(duì)育苗早期水體的總菌和弧菌數(shù)量影響較大。24和72 h滅菌效率由高到低分別為甲醛、二氧化氯、碘、漂白粉，其中甲醛和二氧化氯滅菌具有長(zhǎng)效性和穩(wěn)定性，而碘和漂白粉72 h總菌數(shù)量與對(duì)照組相近。二氧化氯有效氯含量是氯的2.63 倍，殺滅異養(yǎng)菌所需的濃度僅為液氯的一半[13]。溞狀幼體階段，甲醛和二氧化氯組水體的總菌和弧菌數(shù)量低于對(duì)照組、漂白粉和碘組，表明甲醛和二氧化氯殺菌效果較好。隨著幼體發(fā)育，育苗水體總菌和弧菌數(shù)量上升，各組中碘組的總菌數(shù)最低而弧菌數(shù)量最高，甲醛組的弧菌數(shù)最低。

消毒劑除了殺菌和控制有害藻類作用外，還能增氧并分解水體中的有害物質(zhì)，降低亞硝酸鹽等有害物濃度，有效改善水質(zhì)[12-13]。本研究中，使用不同消毒劑前后氨氮和亞硝酸鹽質(zhì)量濃度無(wú)顯著差異；除仔蝦階段碘和二氧化氯組水體氨氮濃度高于對(duì)照組外，其余2種消毒劑組育苗水體氨氮和亞硝酸濃度均低于對(duì)照組，漂白粉組最低，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)使用4種消毒劑可改善育苗水體水質(zhì)。

幼體不同發(fā)育階段，甲醛組幼體成活率最高，其次是漂白粉組。這與甲醛組水體弧菌數(shù)量少及較低的亞硝酸鹽濃度有關(guān)，且與漂白粉組水體氨氮和亞硝酸濃度低相關(guān)。崔子予等[14]認(rèn)為保持凡納濱對(duì)蝦育苗水體的弧菌數(shù)量穩(wěn)定，對(duì)增加水體穩(wěn)定性，提高對(duì)蝦育苗成活率具有意義。

3.2 消毒劑對(duì)育苗水體和幼體微生物菌落結(jié)構(gòu)的影響

本研究中，在育苗水體和幼體中鑒定出微生物屬種237種，不同處理組的主要優(yōu)勢(shì)菌屬與楊碩[15]報(bào)道凡納濱對(duì)蝦腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬結(jié)果相似。4種消毒劑對(duì)早期 (N6—Z1) 階段育苗水體中的優(yōu)勢(shì)菌屬種類和豐度影響均較大，使用不同消毒劑0、48、96 h后各組優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬種類和優(yōu)勢(shì)度 (百分比)不同。0和48 h后，對(duì)照組、碘和二氧化氯組優(yōu)勢(shì)菌為東吉科拉屬和紅桿菌屬，而甲醛和漂白粉組優(yōu)勢(shì)菌為假交替單胞菌屬、交替單胞菌屬和嗜甲基菌屬。隨著消毒時(shí)間延長(zhǎng)，96 h后不同實(shí)驗(yàn)組水體優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬種類趨近，優(yōu)勢(shì)種類的數(shù)量增加但豐度降低。M1和P1期各組水體的優(yōu)勢(shì)菌屬種類相似，以東吉科拉屬、OM43_clade、弧菌屬、黏著桿菌屬、Phaeodactylibacter、念珠菌屬 (Candidatus-Cquiluna) 和埃希氏桿菌屬等為主，只是各組不同菌屬的豐度存在差異。

OM43_clade屬β-變形菌綱嗜甲基菌科，在全球海洋環(huán)境和其他水生環(huán)境中C1化合物的代謝中發(fā)揮著重要作用[16]。赤桿菌屬屬α-變形菌綱、赤桿菌科，在土壤、熱泉、海水中廣泛分布，部分菌株具有細(xì)菌葉綠素a，營(yíng)好氧異養(yǎng)生長(zhǎng)兼具光合作用功能，在全球海洋碳循環(huán)和能量代謝過(guò)程中起重要作用[17]。交替赤桿菌屬 (Altererythrobacter) 主要來(lái)源于海洋環(huán)境，具有生物降解、產(chǎn)類胡蘿卜素、產(chǎn)細(xì)胞毒素和產(chǎn)酶等功能[17]。泥灘微菌屬屬于擬桿菌門黃桿菌綱，具有硝酸鹽還原功能。Phaeodactylibacter、芽孢桿菌屬 (Bacillus) 和鹽單胞菌屬是三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 養(yǎng)殖水體優(yōu)勢(shì)屬，在有機(jī)質(zhì)降解和氮磷循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用[18]。東吉科拉屬和Roseibacterium通常在水生環(huán)境中占主導(dǎo)地位，并促進(jìn)氮化合物的降解[19-20]。黃桿菌屬是一種黏附能力較強(qiáng)的細(xì)菌，可能影響幼體的活力和蛻皮而導(dǎo)致其成活率下降，其豐度受水體中有機(jī)物含量影響。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)蝦育苗成活率低的育苗池水體的優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌和弧菌[21]。本研究中對(duì)照組和二氧化氯組水體中的黃桿菌屬、弧菌屬和假交替單胞菌屬為主要優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度高于其他組，這可能與其幼體較低的成活率有關(guān)。

凡納濱對(duì)蝦幼體中的優(yōu)勢(shì)菌屬以鹽單胞菌屬、弧菌屬、不動(dòng)桿菌屬、動(dòng)性桿菌屬、芽孢桿菌屬、微桿菌屬、嗜冷桿菌屬、嗜甲基菌屬和魯杰氏菌屬為主，本研究結(jié)果表明育苗水體和幼體微生物群落存在顯著差異?；【荶1期對(duì)照組和二氧化氯組的第三優(yōu)勢(shì)菌，除漂白粉組外，弧菌屬是M1期各組幼體內(nèi)最占優(yōu)勢(shì)的菌屬。蝦的腸道和周圍環(huán)境的弧菌、假單胞菌和黃桿菌等可能是降低幼體成活率的細(xì)菌性病原體。既往研究報(bào)道，弧菌過(guò)量可改變蝦類健康狀況，引起疾病[22]。研究表明，導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦“早期死亡綜合征”(Early mortality syndrome, EMS) 的病原可能是攜帶有毒性質(zhì)粒的副溶血弧菌 (V. parahaemolyticus) 的特異變種[23-24]?；【呛Ｑ蟓h(huán)境和對(duì)蝦腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，除部分種類為致病菌外，另一些種類則具有硝酸鹽異化作用，對(duì)水體中有機(jī)物的降解具有重要意義[25]。不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬均屬變形菌門γ-變形菌綱，主要分布于水體和環(huán)境中，前者也分布于人的皮膚、咽部、胃、腸道，是人類條件致病菌，而后者具有強(qiáng)耐酸性，主要分布于動(dòng)物和人類胃腸道內(nèi)，可引起腸道炎癥。已有研究證實(shí)變形菌屬是蝦類腸道菌群的主導(dǎo)[26-27]。郁維娜等[28]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦患病蝦腸道中的γ-變形菌綱的相對(duì)豐度顯著高于健康蝦腸道樣品，而α-變形菌綱的相對(duì)豐度顯著低于健康蝦腸道樣品。楊坤杰等[29]發(fā)現(xiàn)在健康幼蝦腸道中α-變形菌綱豐度較高，而在患病幼蝦中γ-變形菌綱和擬桿菌門豐度較高。微桿菌屬屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱，分布廣泛，生存環(huán)境多樣，具有分解復(fù)雜有機(jī)物、轉(zhuǎn)化重金屬、促生長(zhǎng)等極具實(shí)用價(jià)值的功能[30]。芽孢桿菌屬具有強(qiáng)抑制有害菌能力，并能產(chǎn)生拮抗物質(zhì)如抗生素和細(xì)菌素，抑制致病菌的生長(zhǎng)；同時(shí)產(chǎn)生多種消化酶幫助宿主消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而起到防治疾病的效果，已經(jīng)成為改善凡納濱對(duì)蝦健康狀況的益生菌[31]。而Z1期甲醛組幼體的動(dòng)性桿菌屬和芽孢桿菌屬豐度高于其他4組，這可能與甲醛組幼體有較高的成活率有關(guān)。