CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)的臨床實(shí)驗(yàn)室性能驗(yàn)證*

李婧，李林靜，劉轉(zhuǎn)，楊文娟，馬青梅，張安安，楊海棠，劉澤菁，劉欣躍(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，蘭州 730030)

人細(xì)胞色素P450酶等位基因(CYP2C19)編碼的S-美芬妥英羥化酶參與了一系列臨床常用藥物代謝，其中最常見的就是氯吡格雷抵抗[1]。阿司匹林聯(lián)合一種P2Y12受體抑制劑(氯吡格雷、替格瑞洛和普拉格雷)的雙聯(lián)抗血小板治療，是預(yù)防直接經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)術(shù)后支架內(nèi)血栓等再次發(fā)生血栓事件的基石[2]。荷蘭一項(xiàng)歷時(shí)8年的POPular Genetics研究——氯吡格雷基因檢測(cè)相關(guān)臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)證實(shí)，在PCI術(shù)后的ST段抬高性心肌梗死(STEMI)患者中，以CYP2C19基因型指導(dǎo)P2Y12受體抑制劑的個(gè)體化抗血小板降階治療策略，對(duì)于預(yù)防1年內(nèi)血栓事件的療效不劣于替格瑞洛或普拉格雷的強(qiáng)效標(biāo)準(zhǔn)治療，而且出血發(fā)生率更低[3]。因此，本研究擬根據(jù)臨床需求及ISO15189實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的要求[4]，進(jìn)行人類CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)性能驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 納入2018年1月至10月蘭州大學(xué)第二醫(yī)院計(jì)劃進(jìn)行PCI手術(shù)且尚未應(yīng)用任何抗血小板治療藥物的急性心肌梗死患者20例，其中男17例、女3例，年齡(59.6±8.6)歲，所有患者均無家族遺傳史，無血緣關(guān)系。本研究通過蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.2018A-065)。

1.2儀器與試劑 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Qubit3.0核酸定量?jī)x(美國Life Technologies公司)。人CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)及核酸提取試劑盒(蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)公司)，氯化血紅素、膽紅素及膽固醇(北京索萊寶科技公司)。

1.3方法

1.3.1外周血DNA提取 采集急性心肌梗死患者的靜脈血2～3 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存。采用配套核酸提取試劑盒提取并純化DNA。采用Qubit3.0核酸定量?jī)x定量DNA濃度，取DNA濃度高于50 ng/μL、吸光度(A260/280 nm)值為1.7～2.0的樣本，置于-20 ℃保存。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增 按照人CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)說明書檢測(cè)CYP2C19基因*2(c.681 G/A)位點(diǎn)與*3(c.636 G/A)位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。PCR反應(yīng)體系為每個(gè)樣本各準(zhǔn)備4支PCR反應(yīng)管，分別加入2G、2A、3G、3A的PCR反應(yīng)液23 μL(含PCR 緩沖液、特異性引物和探針、內(nèi)參引物和探針)，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，樣本DNA 1 μL。使用試劑盒自帶的質(zhì)控品進(jìn)行陰、陽性對(duì)照。采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；25 ℃ 1 min。設(shè)置FAM和ROX雙通道采集熒光信號(hào)。對(duì)于DNA樣本檢測(cè)反應(yīng)體系，其內(nèi)參擴(kuò)增曲線的Ct(ROX)值應(yīng)≤20，在內(nèi)參Ct(ROX)值正常的情況下，計(jì)算樣本檢測(cè)信號(hào)Ct(FAM)值與內(nèi)參信號(hào)Ct(ROX)值的差值，即△Ct=|Ct(FAM)-Ct(ROX)|。根據(jù)△Ct值判斷基因型，2G和2A反應(yīng)體系：當(dāng)△Ct≤5時(shí)提示等位基因G或A陽性，當(dāng)△Ct>5 或Ct(FAM)顯示“Undetermined”時(shí)提示G或A陰性；3G和3A反應(yīng)體系：當(dāng)△Ct≤7時(shí)提示等位基因G或A陽性，當(dāng)△Ct>7 或Ct(FAM)顯示“Undetermined”時(shí)提示G或A陰性。最后根據(jù)等位基因G和A的結(jié)果組合成相應(yīng)的基因型。

1.3.3Sanger測(cè)序 取上述20例患者的DNA標(biāo)本，送六合華大基因科技公司上海分公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序儀器為ABI 3730XL高通量分析儀，測(cè)序片段分別為CYP2C19*2(exon5)：atatacaatatattttatttatatttatagttttaaattacaaccagagcttggcatattgtatctatacctttattaaatgcttttaatttaataaattattgttttctcttagatatgcaataattttcccactatcattgattatttcccgggaacccataacaaattacttaaaaaccttgcttttatggaaagtgatattttggagaaagtaaaagaacaccaagaatcgatggacatcaacaaccctcgggactttattgattgcttcctgatcaaaatggagaaggtaaaatg；CYP2C19*3(exon4)：ctgtgatcccactttcatcctgggctgtgctccctgcaatgtgatctgctccattattttccagaaacgtttcgattataaagatcagcaatttcttaacttgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgtaagcaccccctggatccaggtaaggccaagttttttgcttcctgagaaaccacttacagtctttttttctgggaaatccaaaattctatattgaccaagccctgaagtacatttttgaatactacagtcttgcctagacagccatggggtgaatatctggaaaag。符合率≥95%為驗(yàn)證通過。將測(cè)序結(jié)果的2個(gè)位點(diǎn)基因型(加粗斜體標(biāo)注)與熒光PCR檢測(cè)的基因型進(jìn)行對(duì)比分析，以確定熒光PCR檢測(cè)結(jié)果是否為目的片段及相應(yīng)的等位基因。

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1符合率 采用人CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒對(duì)上述已知的20例患者基因型樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)，另取患者的DNA標(biāo)本進(jìn)行Sanger測(cè)序。結(jié)果表明，20例樣本經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Sanger測(cè)序后，共檢測(cè)出5種基因型組合，包含*1/*3(c.681 GG，c.636GA)基因型3例；*1/*2(c.681 GA，c.636GG)基因型5例； *2/*2(c.681 AA，c.636GG)基因型3例；*2/*3(c.681 GA，c.636GA)基因型3例；*1/*1(c.681 GG，c.636GG)基因型6例；實(shí)時(shí)熒光PCR及Sanger測(cè)序結(jié)果完全一致，符合率為100%。見圖1。

注：實(shí)時(shí)熒光PCR法中，F(xiàn)AM通道為檢測(cè)通道，ROX為內(nèi)參通道。Sanger測(cè)序圖中紅圈標(biāo)識(shí)位置為CYP2C19 c.681和c.636位點(diǎn)的突變基因。A，*1/*3(c.681 GG，c.636GA)基因型；B，*1/*2(c.681 GA，c.636GG)基因型；C，*2/*2(c.681 AA，c.636GG)基因型；D，*2/*3(c.681 GA，c.636GA)基因型；E，*1/*1(c.681 GG，c.636GG)基因型。

2.2精密度

表1 CYP2C19實(shí)時(shí)熒光定量PCR精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3檢出限 選擇2例測(cè)序驗(yàn)證基因型為CYP2C19c.681GA、c.636GA的雜合型臨床標(biāo)本，原始DNA濃度分別為51.13 ng/μL和50.76 ng/μL。參考試劑盒說明書“參考品(雜合子)最低檢測(cè)下限低至10 ng/μL”，將這2例標(biāo)本的DNA溶液用DNA洗脫液進(jìn)行等比稀釋，稀釋后的DNA濃度分別為30.15 ng/μL、17.33 ng/μL、9.95 ng/μL和29.42 ng/μL、17.55 ng/μL、9.90 ng/μL。將稀釋后的最低濃度核酸樣本設(shè)置5個(gè)復(fù)孔進(jìn)行PCR基因型檢測(cè)，5次檢測(cè)的基因型結(jié)果與未稀釋原濃度水平的基因型結(jié)果符合率達(dá)100%時(shí)為驗(yàn)證通過。結(jié)果表明，按照說明書提示的最低濃度重復(fù)檢測(cè)5次后的基因型與未稀釋原濃度水平的基因型符合率為100%，驗(yàn)證通過。

2.4抗干擾能力 選擇1例測(cè)序驗(yàn)證基因型為CYP2C19c.681GA、c.636GA的臨床血液標(biāo)本，分裝成10份樣本，每份200 μL，其中1份不添加任何干擾物質(zhì)，作為對(duì)照組，其余9份平均分為3組，每組分別加入3種干擾物質(zhì)——氯化血紅素、膽紅素和膽固醇，配制成血紅蛋白終濃度為20 g/L，總膽紅素終濃度為60 μml/L，總膽固醇終濃度為10.2 mmol/L的溶血、黃疸及脂血標(biāo)本。提取這10份樣本的DNA進(jìn)行PCR基因型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果的符合率≥90%為抗該干擾能力驗(yàn)證通過。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加入氯化血紅素、膽紅素和膽固醇之后的標(biāo)本的基因型與對(duì)照組基因型符合率為100%，即這3種干擾物質(zhì)在試劑盒標(biāo)注的濃度下，對(duì)基因型判斷沒有影響，驗(yàn)證通過。見表2。

表2 CYP2C19實(shí)時(shí)熒光定量PCR抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

為了保證日常檢驗(yàn)項(xiàng)目的質(zhì)量控制工作及檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。本研究從符合率、精密度、檢出限和抗干擾能力4個(gè)方面對(duì)蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)公司的人CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)進(jìn)行了性能驗(yàn)證。

符合率驗(yàn)證為本試劑盒基因型檢驗(yàn)結(jié)果與參考方法Sanger測(cè)序方法的結(jié)果一致性檢驗(yàn)，反映了檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，是確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確發(fā)出的前提和重要環(huán)節(jié)。本研究中納入了甘肅地區(qū)漢族人群中檢出的5種基因型組合，涵蓋了CYP2C19所能檢出的全部基因型。對(duì)5種類型的基因型組合進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，兩種方法的結(jié)果完全一致。

精密度驗(yàn)證分為期間精密度和重復(fù)性的驗(yàn)證，反映了檢測(cè)結(jié)果的再現(xiàn)性，是保證良好準(zhǔn)確度的先決條件，也是反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，本研究重復(fù)性和期間精密度的CV值均小于5%，表明基因型判斷結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

檢出限驗(yàn)證反映了能檢測(cè)出基因型的最低的樣本核酸濃度，本試劑盒的說明書中最低檢出限為10 ng/μL，本次驗(yàn)證將核酸濃度稀釋到略低于10 ng/μL，經(jīng)過連續(xù)5次重復(fù)擴(kuò)增之后，依然可以保證基因型的準(zhǔn)確判斷?？垢蓴_能力驗(yàn)證反映了臨床樣本發(fā)生溶血、黃疸或脂血時(shí)能否正確判定基因型的能力，因臨床標(biāo)本中既要符合溶血、黃疸或脂血又要符合雜合突變基因型的樣本數(shù)量極少，故而本實(shí)驗(yàn)根據(jù)試劑盒說明書中的濃度將臨床樣本進(jìn)行了處理，配制成了不同濃度的溶血、黃疸或脂血樣本，并未影響基因型的準(zhǔn)確判斷。

本次驗(yàn)證的不足之處在于考慮到實(shí)際檢測(cè)的時(shí)效性，加之本實(shí)驗(yàn)已完成驗(yàn)證過程，未對(duì)更低的核酸濃度進(jìn)行基因型檢測(cè)的嘗試；若條件允許，應(yīng)適當(dāng)增加精密度驗(yàn)證的天數(shù)，使期間精密度檢測(cè)數(shù)據(jù)更加完善。