羧肽酶A4活化STAT3促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲*

禹卓玥，張蕙雯，楊婷，牛亞楠，孫立新，劉軍，遇瓏，冉宇靚，孫力超(國(guó)家癌癥中心，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

肝細(xì)胞癌(HCC)屬于臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤。羧肽酶A4(carboxypeptidase A4,CPA4)屬于金屬蛋白酶家族，可在鋅離子的參與下切割肽或蛋白質(zhì)的C端殘基[1]。CPA4基因位于染色體7q32區(qū)域，在細(xì)胞增殖和分化中具有潛在作用[2]。研究表明，CPA4的突變或印記異?？赡軙?huì)影響前列腺癌的侵襲性[3]。據(jù)報(bào)道，CPA4在胰腺癌、胃癌、食管癌等多種腫瘤組織中呈異常高表達(dá)，且與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[4]。然而，CPA4在肝癌中的功能及分子機(jī)制尚不清楚。本研究探討了CPA4在體外對(duì)2種肝癌細(xì)胞系的增殖、遷移、侵襲能力的影響，并初步研究其分子機(jī)制，旨在為尋找肝癌診斷和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系、試劑及儀器 肝癌細(xì)胞系MHCC97H、MHCC97L均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM F12培養(yǎng)基和胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(天津康源生物公司)，RIPA裂解液、脫脂奶粉、ECL發(fā)光液(北京普利萊公司)，兔抗CPA4多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司)，兔抗GAPDH多克隆抗體(美國(guó)Bioworld公司)，兔抗STAT3單克隆抗體、兔抗p-STAT3(Tyr705)單克隆抗體和兔抗c-myc單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(美國(guó)Jackson公司)，CPA4過(guò)表達(dá)和干擾慢病毒載體(上海和元生物公司)，CCK8試劑(日本同仁化學(xué)研究所)，10 g/L的結(jié)晶紫溶液(北京索萊寶公司), 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金公司)，SYBR Green Premix Ex Taq(上海翊圣生物公司)，qRT-PCR引物(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司)，PVDF膜和Transwell小室(美國(guó)Millipore公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，450型酶聯(lián)儀、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)，超微量分光光度計(jì)(德國(guó)FoodALYT公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 取凍存的肝癌細(xì)胞系MHCC97L和MHCC97H，復(fù)蘇后，重懸于含10%胎牛血清的DMEM F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

CPA4過(guò)表達(dá)載體和干擾載體的病毒包裝、滴度測(cè)定均由上海和元生物技術(shù)公司完成。shRNA的靶標(biāo)序列：shCPA4：5′-GTATGACAACGGCATCAAA-3′。按慢病毒操作手冊(cè)進(jìn)行感染，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌MHCC97L和MHCC97H細(xì)胞分別以5×104個(gè)/孔的密度接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，保證第2天感染病毒時(shí)融合率達(dá)30%～40%。更換為950 μL新鮮培養(yǎng)基，分別用50 μL包裝過(guò)表達(dá)CPA4及其對(duì)照(vector組)的病毒感染肝癌MHCC97L細(xì)胞，另用50 μL包裝shCPA4及其對(duì)照(shNC組)的病毒感染肝癌MHCC97H細(xì)胞，4組細(xì)胞均加入5 μL聚凝胺(1 mg/mL)。病毒感染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。最終得到MHCC97L-vector、MHCC97L-CPA4、MHCC97H-shNC和MHCC97H-shCPA4共4組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 收集各組數(shù)量約為5×106個(gè)且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97L和MHCC97H細(xì)胞，通過(guò)Trizol法提取總RNA，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度,選取濃度大于125 ng/μL，吸光度比值(A260/280 nm)為1.9～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，置于-80 ℃保存。各組均取1 μg RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃保存。引物序列參考文獻(xiàn)[4]，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司合成。GAPDH上游引物序列：5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT-3′，下游引物序列：5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′；CPA4上游引物序列：5′-CCAGATGCCGAGGAAC-3′,下游引物序列：5′-TACGCCCAGTCGATGC-3′。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×Power SYBR Green PCR Mastre Mix 10 μL，模板DNA 2 μL，無(wú)RNA酶水補(bǔ)足體積至20 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。于60 ℃時(shí)用Step One Plus軟件采集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線分析，采用相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt法計(jì)算。以GAPDH作為內(nèi)參照，用CPA4與相應(yīng)GAPDH的Ct差值表示樣品中目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3總蛋白質(zhì)提取及western blot 收集各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97L和MHCC97H細(xì)胞(約5×106個(gè))，加入250 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上靜置30 min，每隔10 min顛倒混勻1次，12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清，采用BCA試劑盒進(jìn)行定量。分別取35 μg總蛋白質(zhì)樣品，進(jìn)行含10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，積層膠采用90 V電壓，分離膠采用120 V電壓)，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(80 V電壓2 h)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜置于50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h后，PVDF膜置于目的一抗中[稀釋比例分別為兔抗CPA4多克隆抗體1∶200；兔抗GAPDH多克隆抗體1∶5 000；兔抗STAT3單克隆抗體1∶1 000;兔抗p-STAT3(Tyr705)單克隆抗體1∶500；兔抗c-myc單克隆抗體 1∶1 000]，4 ℃溫育過(guò)夜。TBST洗滌4次，每次8 min，用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)室溫溫育1 h，TBST洗滌4次，每次8 min，加入ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影。蛋白質(zhì)條帶灰度值用ImageJ軟件測(cè)定，目的蛋白條帶相對(duì)灰度值=目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4CCK8試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn) 取各組呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌MHCC97L和MHCC97H細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以2 500個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2孵箱中分別于培養(yǎng)0、24、48、72和96 h時(shí)加入100 μL 10% CCK8試劑，溫育2 h后，使用酶聯(lián)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度(A值)，取其均值，繪制生長(zhǎng)曲線。

取各組呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌MHCC97L和MHCC97H細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋為1×106/mL,10倍梯度稀釋至濃度為1×103/mL，每組分別接種500 μL于培養(yǎng)皿中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使細(xì)胞分散均勻。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)10～12 d，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，PBS洗滌2次，無(wú)水乙醇固定30 min，棄去固定液，10 g/L結(jié)晶紫染液染色30 min，PBS洗滌2次，空氣干燥，拍照，肉眼直接計(jì)數(shù)克隆(大小約0.3～1.0 mm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell遷移試驗(yàn) 將Transwell小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為2.5×105/mL濃度的懸液，取200 μL加入至小室的上室，下室加入650 μL 10%完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次，無(wú)水乙醇室溫固定30 min，PBS洗滌2次,用棉簽擦去上室細(xì)胞，10 g/L結(jié)晶紫染液染色30 min，PBS洗滌2次，晾干，切下小室并用中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下觀察及拍照，隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Transwell侵襲試驗(yàn) 將Transwell小室置于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，提前在每個(gè)小室中加入100 μL稀釋好的基質(zhì)膠(基質(zhì)膠∶雙無(wú)培養(yǎng)基=1∶9)，37 ℃、5%CO2條件下溫育1～2 h，棄去多余基質(zhì)膠。用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋為2.5×105/mL濃度的懸液，取200 μL加入至小室的上室，下室加入650 μL 10%完全培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次，無(wú)水乙醇室溫固定30 min，PBS洗滌2次,用棉簽擦去上室細(xì)胞，10 g/L結(jié)晶紫染液染色30 min，PBS洗滌2次，晾干，切下小室并用中性樹(shù)脂封片。顯微鏡下觀察及拍照，隨機(jī)選取3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1western blot和qRT-PCR檢測(cè)CPA4mRNA及蛋白質(zhì)在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá) western blot和qRT-PCR分析證實(shí)肝癌細(xì)胞系MHCC97H和MHCC97L均表達(dá)CPA4mRNA及蛋白質(zhì)，且CPA4mRNA及蛋白質(zhì)在MHCC97H細(xì)胞中的表達(dá)高于MHCC97L細(xì)胞。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 western blot檢測(cè)CPA4蛋白在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

表1 western blot和qRT-PCR檢測(cè)CPA4 mRNA及蛋白質(zhì)在肝癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)

2.2western blot和qRT-PCR檢測(cè)CPA4mRNA及蛋白質(zhì)在肝癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá) western blot和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，CPA4mRNA及蛋白質(zhì)在MHCC97L-CPA4組細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于MHCC97L-vector組，而在MHCC97H-shCPA4組細(xì)胞的表達(dá)水平明顯低于MHCC97H-shNC組。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 western blot檢測(cè)CPA4蛋白在肝癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)

表2 western blot和qRT-PCR檢測(cè)CPA4 mRNA及蛋白質(zhì)在肝癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3CCK8試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞體外增殖能力 CCK8試驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝癌MHCC97L細(xì)胞中，與vector組相比，CPA4組細(xì)胞增殖能力顯著提高。見(jiàn)圖3A、表3。在MHCC97H細(xì)胞中，與shNC組相比，shCPA4組細(xì)胞增殖能力顯著降低。見(jiàn)圖3B、表3。克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，在肝癌MHCC97L細(xì)胞中，vector組和CPA4組的克隆形成數(shù)分別為(183.3±34.74)個(gè)和(407.0±18.45)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.686，P=0.005)。見(jiàn)圖3C。在肝癌MHCC97H細(xì)胞中，shNC組和shCPA4組的克隆形成數(shù)分別為(371.3±39.57)個(gè)和(137.7±30.28)個(gè)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.690，P=0.009)。見(jiàn)圖3D。

表3 CCK8試驗(yàn)中不同時(shí)間點(diǎn)不同組別肝癌細(xì)胞的A值

注：A，CCK8試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)CPA4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響；B，CCK8試驗(yàn)檢測(cè)敲減CPA4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響;C，克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)CPA4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響；D，克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)敲減CPA4對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響;*，P<0.01。

2.4Transwell試驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的體外遷移能力 結(jié)果顯示，在肝癌MHCC97L細(xì)胞中，vector組和CPA4組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為(23.00±2.34)個(gè)和(123.50±2.18)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.81，P<0.000 1)。見(jiàn)圖4A。在肝癌MHCC97H細(xì)胞中，shNC組和shCPA4的遷移細(xì)胞數(shù)分別為(135.30±6.42)個(gè)和(30.00±4.39)個(gè)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.52，P<0.000 1)。見(jiàn)圖4B。

注：A，Transwell試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)CPA4對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響；B，Transwell試驗(yàn)檢測(cè)敲減CPA4對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。

2.5Transwell試驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞的體外侵襲能力 結(jié)果顯示，在肝癌MHCC97L細(xì)胞中，vector組和CPA4組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(26.75±2.39)個(gè)和(112.30±9.43)個(gè), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.782，P=0.000 1)。見(jiàn)圖5A。在肝癌MHCC97H細(xì)胞中，shNC組和shCPA4組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(184.00±4.22)個(gè)和(32.57±2.49)個(gè)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=30.83，P<0.000 1)。見(jiàn)圖5B。

注：A,Transwell試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)CPA4對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響;B,Transwell試驗(yàn)檢測(cè)敲減CPA4對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。

2.6western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞中STAT3通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 結(jié)果顯示，在肝癌MHCC97L細(xì)胞中，與vector組比較，CPA4組的STAT3總蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而p-STAT3和c-myc蛋白表達(dá)水平顯著升高；在肝癌MHCC97H細(xì)胞中，與shNC組比較，shCPA4組的STAT3總蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而p-STAT3和c-myc蛋白的表達(dá)水平顯著降低。見(jiàn)圖6、表4。

圖6 western blot檢測(cè)CPA4基因?qū)Ω伟┘?xì)胞中STAT3通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

表4 western blot檢測(cè)CPA4基因?qū)Ω伟┘?xì)胞中STAT3通路相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

3 討論

CPA4是羧肽酶A/B亞家族的成員，最早在由丁酸鈉誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞分化過(guò)程上調(diào)的mRNA中被篩選鑒定出[5]。在本研究中，通過(guò)慢病毒載體感染分別建立CPA4過(guò)表達(dá)和敲減肝癌細(xì)胞系，CCK8試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CPA4可以顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，而敲減CPA4后則顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，與Pan等[6]在結(jié)直腸癌研究中以及Fu等[7]在非小細(xì)胞肺癌研究中的結(jié)果具有一致性，提示CPA4可能具有作為抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療靶點(diǎn)的潛力。同時(shí)，本研究通過(guò)Transwell試驗(yàn)證實(shí)CPA4過(guò)表達(dá)后可以顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲，而敲減CPA4則能顯著抑制肝癌細(xì)胞遷移、侵襲。表明CPA4可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。CPA4通過(guò)激活PI3K-AKT-mTOR通路促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促使胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移、侵襲[8]；CPA4還能通過(guò)激活STAT3和Erk，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移、侵襲[6]；同時(shí)，血清中CPA4含量可以預(yù)示臨床結(jié)腸癌患者的肝轉(zhuǎn)移[9]，提示CPA4具有作為肝癌生物標(biāo)志物的潛力。

目前，尚未明確CPA4發(fā)揮其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。作為一種可溶性外泌蛋白酶，CPA4在細(xì)胞外環(huán)境發(fā)揮重要作用，其神經(jīng)肽底物已經(jīng)被證實(shí)與細(xì)胞增殖和分化的調(diào)節(jié)相關(guān)[1]，而CPA4使得這些肽失活，可能會(huì)刺激腫瘤細(xì)胞的增殖或增強(qiáng)腫瘤的細(xì)胞移動(dòng)性，這為CPA4與某些癌癥的侵襲性之間的聯(lián)系研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一些新的研究報(bào)道為CPA4的分子機(jī)制研究提供了多項(xiàng)新的線索；如Shao等[8]報(bào)道在胰腺癌中CPA4通過(guò)激活PI3K-AKT-mTOR通路發(fā)揮重要作用；Pan等[6]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中CPA4的功能與STAT3和Erk的激活相關(guān)。

STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STATs)家族的成員，是該家族中與促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和免疫抑制最密切相關(guān)的成員，通常在腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞中過(guò)度激活[10]。STAT3的過(guò)度激活在多種致癌過(guò)程中具有重要作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、防止細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)生存因子和建立不受控制的生長(zhǎng)[11]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)CPA4使肝癌細(xì)胞中磷酸化STAT3和c-myc的表達(dá)水平升高；而敲減CPA4使肝癌細(xì)胞中磷酸化STAT3和c-myc的表達(dá)水平也降低。研究表明，STAT3蛋白的持續(xù)激活能夠提高c-myc、周期蛋白D1的表達(dá)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、惡化；同時(shí)，STAT3的活化可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[12]。因此，本研究認(rèn)為CPA4可能是通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而在肝癌生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。然而，本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了STAT3信號(hào)通路的改變，而PI3K-AKT-mTOR通路和Erk通路對(duì)于CPA4功能的影響尚未進(jìn)行研究，CPA4的下游直接相互作用靶點(diǎn)也尚未確定，還需要進(jìn)一步深入的研究來(lái)闡明其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制，以確認(rèn)CPA4和STAT3作為肝癌治療和診斷靶點(diǎn)的潛能。