百合LoNHX2基因的克隆與表達(dá)分析

王安琪，薛曉霞，左 楊，張克中，崔金騰

(北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室/北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

百合多數(shù)品種喜微酸性土壤，但北方地區(qū)的土壤偏堿，對(duì)百合根系造成持續(xù)鹽堿脅迫，嚴(yán)重影響種球生長(zhǎng)和產(chǎn)量。目前對(duì)百合鹽脅迫的研究主要集中在生理生化特性研究，有報(bào)道0.8%～0.9%的NaCl可能是百合所承受的最大鹽脅迫濃度[1]；劉艷妮等在1%鹽濃度脅迫下對(duì)亞洲百合進(jìn)行抗鹽性突變體篩選，得到抗鹽性誘變百合植株[2-3]；左志銳等比較2個(gè)百合的葉綠體和線粒體的超微結(jié)構(gòu)，研究了品種'Sorbonne'和'Prato'在低鹽處理下的結(jié)構(gòu)變化[4]。

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取、代謝產(chǎn)物釋放以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛的細(xì)胞活動(dòng)中起著重要的作用[5]。已有研究表明植物體內(nèi)存在多個(gè)與Na+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白,如液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(vacuolar Na+/H+antiporter/exchanger,NHX)和細(xì)胞質(zhì)膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Salt Overly Sensitive,SOS)[5]。液泡膜NHX蛋白主要行使Na+在液泡中區(qū)域化的功能，在提高植物耐鹽性方面發(fā)揮了重要作用[6]。He等將擬南芥AtNHX1轉(zhuǎn)入棉花后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花能在高濃度NaCl條件下正常生長(zhǎng)[7]。目前，NHX2基因研究較多，已在擬南芥[8]、羽衣甘藍(lán)[9]、番茄[10]、小麥[11]、大葉藻[12]等多種植物中克隆出來(lái)，并做了進(jìn)一步研究。另外，NHX基因在轉(zhuǎn)基因植物擬南芥、番茄、茄果和水稻中也證實(shí)了耐鹽性的改善[8]，但NHX基因在百合中尚少有相關(guān)研究。

百合為鹽敏感植物，土壤鹽堿化現(xiàn)象一直是困擾百合種植生產(chǎn)的重要問(wèn)題，研究百合鹽脅迫機(jī)理及其耐鹽適應(yīng)性，在理論和應(yīng)用方面都具有重要意義。就此以O(shè)T型(東方百合與喇叭百合系間雜種)百合‘Robina’為材料，用200 mM NaCl對(duì)百合種球進(jìn)行處理，分析百合LoNHX2基因在不同時(shí)間及不同部位的表達(dá)狀況，為研究百合鹽脅迫下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采用OT型百合品種‘Robina’為材料，取若干種球種于北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地溫室內(nèi)，生長(zhǎng)期間進(jìn)行常規(guī)管理，待生長(zhǎng)30 d后，用200 mM NaCl溶液對(duì)種植30 d的百合進(jìn)行處理，分別取處理后的0、6 h、12 h、24 h的百合根系，同時(shí)，取常規(guī)培養(yǎng)的盛花期百合的根、莖、葉、花瓣、鱗莖，以上材料包上錫箔紙快速放入液氮中備用。

1.2 百合RNA的提取及cDNA的合成

使用植物 RNA 快速提取試劑盒(EASYspin Plus，艾德萊)提取根系樣品的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，最后用紫外核酸蛋白測(cè)定儀調(diào)節(jié)cDNA模板濃度至基本一致。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.3 百合LoNHX2基因的克隆

根據(jù)課題組前期已有的百合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的非重復(fù)序列基因unigene，查找LoNHX2基因，對(duì)LoNHX2基因的unigene進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)5′端較完整，3′端有缺失。參照3-′RACE試劑盒(TaKaRa)操作步驟分別進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增，設(shè)計(jì)3′RACE特異性引物3′GSP(GAAAAGTGGAGATTTGTCAGCA)和3′NGSP(AATCCCTATTTTCGTCGCTCAT)，并測(cè)序，通過(guò)DNAMAN軟件拼接，獲得LoNHX2基因全長(zhǎng)cDNA。再根據(jù)最大開放閱讀框設(shè)計(jì)上游引物L(fēng)oNHX2-F(ATGGGTATCGATTTGGAGCCGG)和下游引物L(fēng)oNHX2-R(TCATTCCCATTCAGGGACGCTT)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用 DNA回收試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行切膠回收，用pMD19-T Vector連接轉(zhuǎn)化并測(cè)序。

1.4 百合LoNHX2基因熒光定量分析

對(duì)200 mM NaCl溶液處理0、6 h、12 h、24 h后的百合根系的LoNHX2基因進(jìn)行qRT-PCR，參照LoNHX2基因全長(zhǎng)cDNA設(shè)計(jì)上游引物L(fēng)oNHX2-YGF(TTTTCCGCAACTTTATGACC)和下游引物L(fēng)oNHX2-YGR(CCTATCTCCCGTGAACCTAT)，內(nèi)參上游引物L(fēng)oactin-F(GCATCACACCTTCTACAACG)和內(nèi)參下游引物L(fēng)oactin-R(GAAGAGCATAACCCTCATAGA)。利用SYBR Premix Ex Taq II試劑盒(TaKaRa)在熒光定量PCR儀(Bio-Rad IQ5)上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq II(2×)12.5 μL；LoNHX2-YGF/Loactin-F 1 μL；LoNHX2-YGR/Loactin-R 1 μL；不同階段的cDNA模板1 μL；dH2O 9.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性2 min; 95 ℃變性10 s, 58～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)。采用Loactin作為內(nèi)參基因，引物為L(zhǎng)oactin-F和Loactin-R。每個(gè)樣品生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)3次。

1.5 百合LoNHX2基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)生物信息相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)信息和在線程序?qū)Π俸系腖oNHX2基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果分析其生物學(xué)意義。所使用的軟件和程序?yàn)椋?MEGA5.12、Protparam以及DNAMAN軟件；NCBI、ORFfinder、TMpred Sever、SignaIP 4.1 Server、Phytozome v12.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合根系總RNA提取質(zhì)量分析

對(duì)提取的百合根系總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶完整(圖1)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 百合LoNHX2基因3’RACE克隆

在課題組前期進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中已有的LoNHX2 unigene序列的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)3’-RACE后，將目的條帶進(jìn)行切膠回收、pMD19-T Vector連接轉(zhuǎn)化及菌液測(cè)序，得到1條501 bp條帶(圖2)。

2.3 百合LoNHX2基因全長(zhǎng)cDNA的克隆結(jié)果

使用DNAMAN，將LoNHX2基因的unigene序列與3’RACE克隆序列進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)cDNA序列。用在線程序ORF Finder找出LoNHX2基因的最大開放閱讀框ORF。在ORF外設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR。如圖3和圖4所示，得到一條1 608 bp片段，編碼535個(gè)氨基酸。將測(cè)序結(jié)果與拼接結(jié)果在DNAMAN中比對(duì)，結(jié)果100%相似。

2.4 百合LoNHX2基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果

通過(guò)ProtParam分析表明，百合LoNHX2基因編碼的氨基酸序列分子式為C2751H4267N677O736S28，相對(duì)分子量為59 498.92，理論等電點(diǎn)(PI)為7.27，不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index II)為36.67，小于閾值，表明百合LoNHX2為穩(wěn)定蛋白；總平均親水性(GRAVY)為0.496，應(yīng)該為脂溶性蛋白。LoNHX2由20種氨基酸組成，其中Leu(63，11.8%)、Ser(46，8.6%)、Phe(45，8.4%)、Val(44，8.2%)和Ile(40,7.5%)含量較豐富。所有氨基酸殘基中帶負(fù)電荷和正電荷的氨基酸殘基數(shù)分別為41(Asp+Glu)、41(Arg+Lys)。

TMpredServer在線預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)表明，該蛋白由內(nèi)向外有11個(gè)跨膜螺旋，分布于氨基酸的21～41、50～66、75～97、107～128、147～166、219～238、271～289、303～324、342～359、384～400、417～436位置上；由外向內(nèi)有12個(gè)跨膜螺旋，分布于氨基酸的21～41、51～68、76～99、111～131、148～165、170～191、218～238、268～286、303～321、338～359、382～400、416～435位置上，因此，該蛋白應(yīng)是跨膜蛋白。SignaIP 4.1 Server分析表明，百合LoNHX2蛋白沒(méi)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。LoNHX2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)表明，該蛋白中，α-螺旋(Alpha helix)和延伸鏈(Extended strand)所占比例最多，分別為為33.83%、31.03%，其次是無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)和β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)，分別占23.18%、11.96%。

2.5 百合LoNHX2蛋白序列同源性分析結(jié)果

利用DNAMAN將LoNHX2基因序列翻譯為氨基酸序列，通過(guò)Phytozome v12.1數(shù)據(jù)庫(kù)在其他物種中的NHX2蛋白序列，進(jìn)行同源性比對(duì)結(jié)果(圖6)表明，百合LoNHX2蛋白與其他物種的NHX2蛋白相似性較高，與擬南芥、水稻和玉米相似度分別為90.51%、89.42%、90.69%。

經(jīng)NCBI中的CDD分析(圖7)表明，百合LoNHX2蛋白具有液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NHX)家族的特征，有NhaP和Na-H exchanger特異性位點(diǎn)，且有典型的結(jié)構(gòu)域b-cpa1、NhaP2、PRK05326。

從Phytozome v12.1數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)雙子葉植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蘋果(Malusdomestica)、葡萄(Vitisvinifera)、千穗谷(Amaranthushypochondriacus)、耬斗菜(Aquilegiacoeruleav)、番茄(Solanumlycopersicum)、番木瓜(Caricapapaya)、毛果楊(Popolustrichocarpa)、甜橙(Citrussinensis)、野草莓(Fragariavesca)，對(duì)單子葉植物如玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、百合(Liliumhybrids)、小葉果蕉(Musaacuminata)，對(duì)石松綱植物江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)，孢子植物地錢(Marchantiapolymorpha)和綠藻綱植物團(tuán)藻(Volvoxcarteri)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)的全基因組進(jìn)行BLAST比對(duì)，檢索LoNHX2蛋白的同源序列，利用MEGA5.2鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖8)。根據(jù)進(jìn)化樹可知，百合(Liliumhybrids)與小葉果蕉(Musa acuminata)聚在一個(gè)分支，可信度為100%，與單子葉植物有較近的同源關(guān)系，體現(xiàn)了較近的親緣關(guān)系。

2.6 百合LoNHX2基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析

在盛花期取百合‘Robina’的根、莖、葉、花瓣、鱗莖部位，分析LoNHX2基因在不同部位的表達(dá)量。由圖9可知，盛花期百合的根、莖、葉、花瓣、鱗莖中均有LoNHX2基因的表達(dá)，且LoNHX2基因在花瓣中表達(dá)量最高，其次是葉片、莖、根，在鱗莖部位表達(dá)量最低。

在百合Robina種植30 d時(shí)，用200 mM NaCl對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫，在處理0、6 h、12 h、24 h時(shí)，取百合根系并提取百合根系RNA，分析各處理時(shí)期LoNHX2基因的表達(dá)量變化。由圖10可看出，在200 mM NaCl處理后，LoNHX2基因在根部的表達(dá)量呈先上升再下降趨勢(shì)。處理12 h時(shí)表達(dá)量最高，處理0時(shí)表達(dá)量最低。說(shuō)明在鹽脅迫下，百合LoNHX2基因含量逐漸升高，而LoNHX2基因的積累可以降低植物細(xì)胞內(nèi)Na+的濃度，防止植物受Na+毒害，由此提高百合的耐鹽性。

3 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中已知的百合LoNHX2基因片段序列，設(shè)計(jì)3’端引物，通過(guò)巢式PCR擴(kuò)增，克隆得到大小為501 bp的3’端序列。將克隆得到的3’端序列與已知序列拼接，得到LoNHX2基因全長(zhǎng)cDNA序列，在最大開放閱讀框ORF外設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異性引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到大小為1 608 bp的全長(zhǎng)序列，其中包括起始密碼子ATG和終止密碼子TGA，共編碼525個(gè)氨基酸。用DNAMAN軟件將其翻譯為蛋白序列后發(fā)現(xiàn)，百合LoNHX2蛋白的分子式為C2751H4267N677O736S28，相對(duì)分子量為59 498.92，理論等電點(diǎn)(PI)為7.27，該蛋白為脂溶性蛋白、穩(wěn)定蛋白。LoNHX2蛋白由20種氨基酸組成，蛋白由內(nèi)向外有11個(gè)跨膜螺旋，由外向內(nèi)有12個(gè)跨膜螺旋，無(wú)信號(hào)肽。二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋(Alpha helix)和延伸鏈(Extended strand)所占比例最多。LoNHX2蛋白序列與擬南芥、水稻、玉米相似度分別為90.51%、89.42%、90.69%。

在獐毛中，用400 mM NaCl處理6 h后，根部AINHX1基因的的表達(dá)量相對(duì)于莖部明顯升高，說(shuō)明根部對(duì)鹽脅迫更敏感。在處理6 h和12 h時(shí)，根部AINHX1基因的的表達(dá)量比對(duì)照CK分別上升了6倍和8倍，處理24 h后表達(dá)量降低[13]。本試驗(yàn)結(jié)果與這一致。本試驗(yàn)中，在200 mM NaCl處理后，LoNHX2基因在百合根部的表達(dá)量呈先上升再下降趨勢(shì)。在處理0、3、6、12 h時(shí)表達(dá)量逐漸升高，處理24 h時(shí)表達(dá)量降低。此外，在大麥[14]、水稻[15]、灰綠狼尾草[16]中有相似的表達(dá)狀況。說(shuō)明LoNHX2基因在植物鹽脅迫中有重要作用，可降低細(xì)胞質(zhì)中Na+的濃度，從而降低高鹽脅迫對(duì)植物細(xì)胞的傷害。

在百合不同部位中，LoNHX2基因在花瓣中表達(dá)量最高，其次是葉片、莖、根，表達(dá)量最低的是鱗莖，說(shuō)明LoNHX2基因的表達(dá)具有普遍性，在不同部位表達(dá)差異量較大。這可能與在百合盛花期時(shí)采集樣品有關(guān)，盛花期時(shí)花瓣中各細(xì)胞較為活躍、代謝旺盛，所以LoNHX2表達(dá)量較高，與此同時(shí)葉片、莖等組織部位均已處于成熟期，所以表達(dá)量較低。本研究克隆了百合LoNHX2基因序列，并分析了百合LoNHX2基因在不同時(shí)間及不同部位的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)了LoNHX2基因的表達(dá)規(guī)律，為研究百合鹽脅迫下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了理論參考。