液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度評定

王靜 馬曉靜

摘 要：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法對全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度進(jìn)行評定，并依據(jù)測量不確定度評定的指導(dǎo)文件建立數(shù)學(xué)模型，對測量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品前處理、儀器設(shè)備等不確定度來源進(jìn)行分析和評定，得出擴(kuò)展不確定度為0.19mg/kg，（k=2）。通過評定發(fā)現(xiàn)，樣品重復(fù)性測量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品前處理是該方法不確定度的主要來源。

關(guān)鍵詞：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀? 內(nèi)標(biāo)? 全麥粉? 嘔吐毒素? 不確定度

谷物生長過程中極易受到真菌毒素的污染，這不僅會對糧食產(chǎn)量造成極大影響，還可能給農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失[1，2]。嘔吐毒素是主要存在于小麥、玉米等糧食及其制品中的真菌毒素，人體食用了被嘔吐毒素污染的食物后，會出現(xiàn)惡心、腹瀉、嘔吐等癥狀[3]。因此，檢測小麥中的嘔吐毒素具有非常重要的意義。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀在食品安全檢測中具有準(zhǔn)確度較高、受基質(zhì)干擾影響小等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為檢測嘔吐毒素的主要方法之一[4]。

此外，為了更加準(zhǔn)確地表達(dá)分析結(jié)果，需要引入測量不確定度（以下簡稱“不確定度”），其是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[5，6]。當(dāng)檢測結(jié)果接近臨界值時，不確定度的引入能夠更準(zhǔn)確地反映真實(shí)結(jié)果[7，8]。

本實(shí)驗(yàn)提取全麥粉中嘔吐毒素的過程免去了真菌毒素提取中常用的免疫親和柱凈化處理，提高了提取效率，節(jié)省了人工與成本;采用內(nèi)標(biāo)法對嘔吐毒素進(jìn)行測定并評定不確定度，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定全麥粉中嘔吐毒素的不確定度評定方法[9，10]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)儲備液（103±1.2μg/mL），Sigma-alorich;穩(wěn)定同位素13C15-DON標(biāo)準(zhǔn)溶液（2μg/mL），國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院;乙腈（色譜純）迪馬科技;甲酸（質(zhì)譜級），Sigma;乙酸（色譜級），F(xiàn)isher;蒸餾水，屈臣氏。

1.2 儀器和設(shè)備

QTRAP-5500型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源），美國AB公司;X1R型高速冷凍離心機(jī)，美國熱電公司;PL602-L型分析天平，梅特勒-托利多（上海有限公司）;IKA渦旋混合器，廣州艾卡;QB-212型搖擺式混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;JSFM-Ⅱ型糧食水分測試粉碎磨，中儲糧成都糧食儲藏科學(xué)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制

使用1mL移液槍移取1mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100mL容量瓶中，用初始流動相（乙腈︰水=3︰97）定容，得到嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為1030ng/mL，儲存于4℃冰箱。

分別準(zhǔn)確移取312.5、625、1250、2500、5000μL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)使用液于10mL容量瓶中，加入初始流動相稀釋并定容至刻度，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的濃度分別為32.19、64.38、128.75、257.5、515ng/mL。

1.3.2 樣品前處理過程

準(zhǔn)確稱取5g（精確到0.01g）試樣置于50mL離心管中，加入20mL提取液（乙腈︰水︰乙酸=70︰29︰1），渦旋混勻后置于搖擺式混勻器中振蕩30min，以6000r/min離心10min，吸取0.5mL上清液于1.5mL離心管中，加入0.5mL水并渦旋混勻，在4℃下以12000r/min離心10min，上清液過0.2μm的聚四氟乙烯濾膜。分別吸取180μL濾液和標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線于含有20μL穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)工作液的插管中，渦旋混勻，進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（柱長100mm，柱內(nèi)徑2.1mm，填料粒徑1.7μm）;流速：0.4mL/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣量：2μL。流動相：A相，水（0.1%甲酸）;B相，乙腈（0.1%甲酸）;梯度洗脫。

梯度洗脫程序：0～0.5min，3%B;0.5～1.0min，3%～10%B;1.0～6.0min，10%～90%B;6.0～7.5min，90%B;7.5～7.6min，90%～3%B;7.6～9.0min，3%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測（multi-reaction monitor，MRM）模式;離子源溫度：600℃;質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

不確定度數(shù)學(xué)模型為：

式中：X為樣品中嘔吐毒素的含量（μg/kg），ρ為計(jì)算得到測定液中嘔吐毒素的質(zhì)量濃度（ng/mL），V為加入提取液的體積（20mL），f為稀釋液稀釋因子2，m為樣品質(zhì)量5g。

2.2 不確定度分量的來源分析

根據(jù)數(shù)學(xué)模型及實(shí)驗(yàn)過程，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定全麥粉中嘔吐毒素含量的不確定度來源有以下幾個方面：①樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)引入的不確定度;②樣品質(zhì)量稱量引入的不確定度;③標(biāo)準(zhǔn)儲備液自身的不確定度;④標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋、工作曲線配置、標(biāo)準(zhǔn)曲線最小二乘法擬合產(chǎn)生的不確定度;⑤樣品制備、提取及稀釋過程產(chǎn)生的不確定度;⑥液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的不確定度。此外，同位素內(nèi)標(biāo)13C15-DON引入的不確定度主要體現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制及樣品的內(nèi)標(biāo)溶液的加入，因此可忽略不計(jì)。

2.3 不確定度分量的評定及計(jì)算

2.3.1 樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)引入的不確定度

在重復(fù)性測定條件下，對陽性樣品進(jìn)行6次測定，測定結(jié)果見表2。

測量結(jié)果重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 樣品稱量引入的不確定度

稱量采用百分之一電子分析天平，其最大允差為±0.05g，假定其為矩形分布，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度

2.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液自身的不確定度

已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（103±1.2μg/mL）的擴(kuò)展不確定度為±1.2μg/mL，按正態(tài)分布考慮，k=2，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為： 。

2.3.3.2 工作曲線配制引入的不確定度

工作曲線配制過程的不確定度主要來源于量器自身的誤差，以及溶劑在使用過程中因環(huán)境溫度引起的體積變化。依據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）及《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646-2006）的要求，玻璃量器及移液槍對應(yīng)的最大允許誤差按B類評定，服從矩形分布，? ? ? ? ? ;200μL移液槍的最大允許誤差為0.003mL，1mL移液槍的最大允許誤差為0.01mL，工作曲線配制過程中量器引入的不確定度見表3。

實(shí)驗(yàn)室的溫度變化范圍通常為（20±5）℃，考慮到液體的體積膨脹，20℃時純水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線用初始流動相定容，其膨脹系數(shù)與純水相當(dāng)——近似于2.1×10-4℃，溫度波動按矩形分布計(jì)算，? ? ? ? ，則標(biāo)準(zhǔn)工作曲線配制過程中的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可合成為：

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的不確定度

采用6個濃度梯度的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法重復(fù)測定2次，以濃度比為橫坐標(biāo)，峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)，利用數(shù)據(jù)處理軟件擬合得到線性回歸方程為yi=a×xi+b，式中：a為斜率、b為截距，測定結(jié)果及數(shù)據(jù)計(jì)算見表4。

則由工作曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度計(jì)算公式如下：

S為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差：

式中：p為試樣測試重復(fù)次數(shù)，6次;n為擬合直線的數(shù)據(jù)總數(shù)，12;為試樣測試濃度的平均值;為繪制擬合直線響應(yīng)值（6個）的平均值;xi為標(biāo)準(zhǔn)曲線各個濃度點(diǎn)的值

工作曲線擬合所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.5 樣品稀釋過程的不確定度

稀釋過程中使用20mL單標(biāo)吸量管量取提取液，提取液經(jīng)提取、離心后，用1mL移液槍吸取0.5mL過濾液，并用0.5mL水稀釋，過濾后進(jìn)質(zhì)譜儀測定。依據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程》（JJG 196-2006）的要求，20mL單標(biāo)吸量管的最大允許為誤差按B類評定，服從矩形分布，k= 。提取液中由于乙酸的加入量為微量，故可忽略溫度波動引起的乙酸體積變化。因此，溫度波動引起提取液的體積變化為（1.2×10-3 ×0.7+2.1×10-4×0.29）×5×20=0.0901mL，按均勻分布計(jì)算，? ? ? ? ? ?，合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表5。

則樣品稀釋過程中的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可合成為：

2.3.6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的不確定度

由液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀校準(zhǔn)證書提供的峰面積重復(fù)性不確定度為1.1%，k=2，則由儀器引入的相對不確定度為：

3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成與擴(kuò)展

3.1 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品測量重復(fù)性、樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稀釋、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀等不確定度分量值，見表6。

將各分量合成計(jì)算全麥粉中嘔吐毒素的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

全麥粉中嘔吐毒素的含量為2.441mg/kg，相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：U（W）=2.441×0.0393=0.0959mg/kg。

3.3 擴(kuò)展不確定度

擴(kuò)展不確定度（U），通過使用包含因子k=2，計(jì)算得到：U=U（W）×2=0.0959×2=0.19mg/kg。

全麥粉中嘔吐毒素的含量為（2.441±0.19）mg/kg，k=2。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定全麥粉中的嘔吐毒素，該方法免去了傳統(tǒng)免疫親和柱凈化步驟，減化了樣品前處理過程，通過液相-質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過對各個不確定分量的評定及分析可以看出，樣品重復(fù)性測量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品稀釋是該方法不確定度的主要來源，由于采用內(nèi)標(biāo)法定量，因此忽略了回收率的不確定度。通過評定實(shí)驗(yàn)過程的不確定度，可以有效地控制關(guān)鍵步驟，進(jìn)而減小樣品檢測過程中的偏差，達(dá)到更準(zhǔn)確測定樣品結(jié)果的目的。

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作者簡介：王靜（1982-），女，漢族，工作單位：河北省糧油質(zhì)量檢測中心，職稱：高級工程師，學(xué)歷：碩士，研究方向：糧油質(zhì)量檢測。