黃芩水提取物對(duì)植物軟腐病菌的抑制作用研究

于紫垣 孫悅 李分 楊芬 張瀟潔

摘? ? 要：通過(guò)打孔法和倍比稀釋法研究黃芩水提取物對(duì)植物軟腐病菌的體外抑菌效果，利用分析檢測(cè)系統(tǒng)細(xì)胞主要內(nèi)容物的滲漏問(wèn)題來(lái)檢測(cè)采用黃芩水提取液對(duì)供試菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破壞能力。研究可知：黃芩水提取物能有效抑制植物軟腐病菌的活性，破壞植物軟腐病菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，為黃芩的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃芩;提取物;植物軟腐病菌;抑制作用

文章編號(hào)： 1005-2690（2021）04-0009-02? ? ? ?中國(guó)圖書分類號(hào)： R284.1? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

中藥黃芩指多年草本植物黃芩的干燥根，屬唇形科。黃芩療效確切，具有清熱燥濕、瀉火解毒、安胎、止血等作用，為中醫(yī)常用藥物之一[1]。黃芩可分離出黃苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類主要成分，烯丙醇、石竹烯等揮發(fā)油類物質(zhì)成分，多糖類活性成分，此外還含有鐵、銅、鋅、錳等微量金屬元素。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)黃芩的成分可以在許多疾病中發(fā)揮治療作用，如抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、心血管保護(hù)、抗高血糖和預(yù)防并發(fā)癥等。

雖然使用抗生素可以有效控制并根治許多由細(xì)菌、真菌等引起的感染性疾病，但由于抗生素濫用，導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌株種類數(shù)增長(zhǎng)及細(xì)菌加速變異，降低了抗生素的功效，這已成為當(dāng)前主要臨床藥物治療中最棘手的難題之一。

研究黃芩水提取物對(duì)植物軟腐真菌的體外抑菌作用[2]，為解決耐藥問(wèn)題提供了理論依據(jù)，也為今后研究應(yīng)用提供了參考。

1? ?材料

（1）菌株：植物軟腐病菌的菌種由西北民族大學(xué)中馬實(shí)驗(yàn)室菌種儲(chǔ)藏室提供。

（2）藥物與試劑：黃芩購(gòu)自甘肅省蘭州紫光藥業(yè)有限責(zé)任公司;麥?zhǔn)媳葷峁埽◤V州成儀儀器有限公司）;實(shí)驗(yàn)室內(nèi)制備液體LB肉湯、LB瓊脂平板等。

（3）儀器：儀器名稱與購(gòu)入廠家如表1所示。

2? ?試驗(yàn)內(nèi)容

2.1? ?黃芩水提取物的制備

取黃芩粗粉80 g，按料液比1∶10加入一些純凈水浸泡24 h，加熱回流提取3次，每次2 h過(guò)濾后取上清液抽濾回收，下層濾渣繼續(xù)加入適量的純凈水加熱回流，將3次所取得的濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮，體積至黃芩粗粉的重量80 g，將藥液直接放入凍干機(jī)烘干得到干燥固體后待用，研碎為粉末，即取得凍干粉。

2.2? ?抑菌圈的測(cè)定

取凍干粉加入純凈水稀釋，將其配制成0.125 g/mL的藥液。用滅菌過(guò)的接菌環(huán)挑單菌落置液體LB中放入33 ℃、180 r/min搖床中搖12 h，將菌液在搖床中取出，取2 mL加入新的液體LB中，放入搖床搖2 h，將搖好的菌液離心，倒掉上清液，加入PBS緩沖溶液搖勻，重復(fù)離心兩次，將最終的菌液加入適量的PBS緩沖溶液直至與M=0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷嵯喈?dāng)（測(cè)吸光度為0.1，PBS緩沖液為對(duì)照）。取100 μL菌液均勻的涂滿瓊脂平板，后采用打孔法打孔器打孔，將孔內(nèi)物用殺菌過(guò)的針頭挑出，將80 μL的藥液加入孔中，置33 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑[3]。2.3? ?最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

測(cè)定方法為微量稀釋法[4-5]。取經(jīng)高壓滅菌過(guò)的試管，將已配制好的藥液按照一定倍數(shù)進(jìn)行稀釋，1～10號(hào)試管內(nèi)藥物濃度依次為0.125 g/mL、0.062 5 g/mL、0.031 25 g/mL、0.016 g/mL、0.008 g/mL、0.004 g/mL、0.002 g/mL、0.001 g/mL、0.000 5 g/mL、0.000 25 g/mL、0.000 125 g/mL。將上步制備的菌液用PBS緩沖溶液稀釋100倍后，取2 mL菌液分別加入1～10號(hào)試管中，陰性對(duì)照為第11號(hào)試管（只加2.0 mL液體LB和藥液，不加菌液）;陽(yáng)性對(duì)照為第12號(hào)試管（加入液體LB 2.0 mL、菌液2.0 mL）。后將1～12號(hào)試驗(yàn)管和對(duì)照管置于33 ℃搖床中24 h后取出，觀察澄清度，無(wú)菌生長(zhǎng)最小抑菌濃度（MIC），重復(fù)3組試驗(yàn)。

2.4? ?最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

分別取上述MIC測(cè)定中無(wú)菌生長(zhǎng)的3支試管液體，在無(wú)菌環(huán)境下用高溫滅菌后冷卻的接種棒將試管中各液體均勻涂在固體培養(yǎng)基上，放入33 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)12 h，觀察結(jié)果，無(wú)菌生長(zhǎng)即為MBC。

2.5? ?DPPH法測(cè)定抗氧化活性

采用DPPH法測(cè)定黃芩苷清除自由基能力，反應(yīng)系統(tǒng)中的抗氧化劑可以和DPPH的單電子進(jìn)行配對(duì)而使 517 nm檢測(cè)波長(zhǎng)降低，因此，可根據(jù)517 nm的變化來(lái)檢測(cè)自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)供試藥液的抗氧化能力。黃芩水提取液（溶于DMSO中）設(shè)置8個(gè)濃度梯度，分別為10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400 μmol/L。首先將1 mL 100 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH值5.5）、 0.1 mL 3 mmol/L 的DPPH乙醇溶液和1.87 mL乙醇放入小型離心管中。再將0.03 mL不同濃度配制好的黃芩水提取液加入離心管中，輕晃搖勻，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)20 min后，于517 nm處測(cè)量其吸光度，所得結(jié)果記為A1?？瞻捉M只加入0.03 mL DMSO，其吸光度記為A2。對(duì)照組加入0.03 mL DMSO和0.1 mL l3 mmol/L 的DPPH乙醇溶液，所得結(jié)果記為A3。自由基的清除率是用吸光度來(lái)表示，吸光度減少，代表DPPH分子減少。清除率的計(jì)算公式為：清除率（%）=1-（A1-A2）/A3×100%。

2.6? ?細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的變化

通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分的變化，以檢測(cè)黃芩水提取物對(duì)被測(cè)細(xì)菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破壞能力。將適量藥液加入植物軟腐病菌菌懸液中，使其最終質(zhì)量濃度為1 MIC，作為一個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理組;等量不含藥液的菌懸液作為研究空白對(duì)照組。將以上液體培養(yǎng)基于33 ℃、180 r/min搖床中恒溫培養(yǎng)20 h后，各吸取2 mL 進(jìn)行高速離心（5 000 r/min，10 min），棄去上清液收集菌體;菌體用無(wú)菌生理鹽水經(jīng)離心洗滌兩次，在常溫干燥箱里烘干，4 ℃條件下保存?zhèn)溆?。分別于16 h、24 h在260 nm處測(cè)定細(xì)胞內(nèi)容物的釋放。

3? ?結(jié)果與討論

3.1? ?結(jié)果

（1）黃芩抑菌圈平均直徑為12 mm。植物軟腐病菌對(duì)黃岑水提取液具有中度敏感性，黃芩水提取物對(duì)植物軟腐病菌有一定的抑菌作用。

（2）最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定表明，黃芩水提取液對(duì)植物軟腐病菌最低抑菌濃度為 0.031 25 g/mL。

（3）最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定表明，黃芩水提取液對(duì)植物軟腐病菌最低殺菌濃度為0.062 5 g/mL。

（4）試驗(yàn)結(jié)果顯示，光譜圖中菌體加入藥物前后的紅外吸收光譜非常相似，在藥物作用16 h和24 h后，1 400.35 cm-1處的峰值明顯降低，對(duì)應(yīng)于脂質(zhì)和蛋白質(zhì)中甲基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)及胞嘧啶C-鳥嘌呤A對(duì)的C-N振動(dòng)。如果試驗(yàn)變量均勻，通常降低的峰值高度（即強(qiáng)度）降低，其中，所述官能團(tuán)部分變小。說(shuō)明藥物作用后植物軟腐病菌的細(xì)胞膜及細(xì)胞壁大部分被完全破壞，導(dǎo)致這些細(xì)胞主要內(nèi)容物質(zhì)發(fā)生滲漏，表明黃芩水提取液對(duì)植物軟腐病菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁均有嚴(yán)重影響。

（5）試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩具有較強(qiáng)的DPPH清除能力，且其隨著藥液濃度的加大而增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)， 清除率接近50%;濃度為400 μmol/L時(shí)，其抑制率高達(dá)91%。

3.2? ?討論

黃芩作為我國(guó)常用中藥之一，藥理作用廣泛，具有顯著的抗菌抗氧化作用和重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，需求量大，所含化學(xué)組成成分和分析作用廣。從試驗(yàn)中可以得出黃芩水提取物對(duì)植物軟腐病菌有明顯的抑菌作用。

與傳統(tǒng)抗生素相比，中藥具有多靶點(diǎn)、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)。今后應(yīng)在充分挖掘黃芩潛在藥理作用的同時(shí)，還要注重考慮黃芩及其有效組分藥理活性及具體作用機(jī)制，積極發(fā)現(xiàn)并利用一些尚未被發(fā)現(xiàn)的活性組分。

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（編輯：劉佳欣）