一種基于ATP熒光反應(yīng)的潔凈度檢測系統(tǒng)的開發(fā)與驗證

柳江山 陶文靖 曲連海

摘 要：本文旨在建立一種基于ATP熒光反應(yīng)的潔凈度檢測系統(tǒng)，并對該系統(tǒng)的主要性能指標(biāo)進行驗證，包括線性、重復(fù)性、檢出限及衰減率等，并對檢測結(jié)果進行分析。結(jié)果顯示，本拭子對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限為1.77×10-15mol/L，線性良好;對菌液的檢出結(jié)果為：大腸埃希氏菌檢出限2000CFU、金黃色葡萄球菌檢出限800CFU、酵母菌檢出限10CFU，均線性良好。該系統(tǒng)重復(fù)性良好，在高濃度ATP下，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為8%;在低濃度ATP下，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為13%，均小于15%;在6min內(nèi)，熒光衰減率無明顯變化。故得出結(jié)論，本拭子的靈敏度、線性、重復(fù)性和衰減率指標(biāo)均較好。

關(guān)鍵詞：三磷酸腺苷? ATP熒光? 潔凈度? 驗證

隨著目前國內(nèi)對于食品安全的重視程度越來越高，食品微生物檢測技術(shù)也在不斷革新。傳統(tǒng)的食品微生物檢測方法一般為平板計數(shù)法，但該方法步驟繁瑣，包括培養(yǎng)基制備、滅菌、樣品均質(zhì)與稀釋、制備平板、恒溫培養(yǎng)等多項操作，耗時至少2天，費時費力，已無法滿足食品企業(yè)對于生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測和質(zhì)量控制的需求。此時，ATP熒光技術(shù)作為一種新的檢測技術(shù)提供了新的設(shè)計思路——通過對細胞中的ATP進行檢測，能夠在短時間內(nèi)估算被測物體上殘留的微生物大致數(shù)量，從而實現(xiàn)對食品企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的快速檢測，且能快速報告結(jié)果，在大大縮短檢測時間的同時節(jié)省了人力與物力。

ATP又稱腺嘌呤核苷三磷酸（簡稱“三磷酸腺苷”），是一種不穩(wěn)定的高能化合物，由1分子腺嘌呤、1分子核糖和3分子磷酸基團組成。ATP是生物體內(nèi)最直接的能量來源，其在細胞中能通過與ADP的相互轉(zhuǎn)化實現(xiàn)貯能和放能，從而保證細胞各項生命活動的能量供應(yīng)。ATP生物發(fā)光法是產(chǎn)生于20世紀(jì)70年代中期的一種ATP檢測方法，其檢測原理為在有氧條件下，熒光素酶催化熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)生成氧化熒光素并發(fā)出熒光。因此，熒光強度與ATP含量呈正比，即待測樣品中微生物數(shù)量越多，ATP的含量越高，發(fā)出的熒光越強[1，2]。手持式ATP熒光檢測儀就是基于ATP生物發(fā)光的原理，利用專門研制的熒光檢測儀和ATP涂抹拭子來捕捉和檢測發(fā)光值，以及測定樣本表面微生物污染程度的快速檢測設(shè)備，具有操作簡單、快速、適用范圍廣、攜帶方便、功耗低、對操作人員的專業(yè)技術(shù)水平要求低等優(yōu)點[3-5]。本研究對潔凈度檢測系統(tǒng)進行檢測效果的驗證，分別從檢測靈敏度、線性、重復(fù)性和衰減率這4個方面進行。

1 材料

1.1 儀器與試劑

PureTrustTM智能熒光檢測儀，北京美正生物科技有限公司;ATP表面涂抹拭子，北京美正生物科技有限公司;ATP標(biāo)準(zhǔn)品（相對分子質(zhì)量為507.18），SIGMA;無菌水，北京美正生物科技有限公司。

1.2 菌株

大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、酵母菌（ATCC 10231）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

ATP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制：準(zhǔn)確稱取一定量ATP標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用無菌水溶解并定容，配制成濃度為1.77×10-8mol/L的腺苷-5'-三磷酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用移液槍移取0.1mL ATP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，加入0.9mL無菌超純水，制成濃度為1.77×10-9mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后逐級稀釋成濃度為1.77×10-10、1.77×10-11、1.77×10-12mol/L……1.77×10-16mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于-20℃冷凍，備用。

2 檢測方法

為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，實驗過程需注意以下幾個方面。①實驗過程中，檢測人員必須佩帶手套和口罩，以此避免檢測人員自身攜帶的ATP對實驗結(jié)果造成影響;②拭子需冷藏放置，在使用之前需恢復(fù)至室溫;③取拭子時不能觸碰拭子頭或柄，以免造成污染;④振搖拭子時不能上下?lián)u動;⑤在測量過程中要保持熒光儀垂直。ATP熒光檢測儀以相對光單位（relative light units，RLU）數(shù)值顯示結(jié)果，RLU值與檢測樣本中的ATP含量呈正比。

2.1 靈敏度及線性

2.1.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)品檢測靈敏度

取濃度為1.77×10-10～1.77×10-15mol/L梯度的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液，從ATP表面涂抹拭子中取出棉簽，用移液槍準(zhǔn)確移取20μL ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液滴于棉簽頭上，然后將棉簽插回拭子管內(nèi)并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。

2.1.2 菌體檢測靈敏度

在對菌體進行檢測時，選取較為常見的革蘭氏陽性細菌（大腸埃希氏菌）、革蘭氏陰性細菌（金黃色葡萄球菌）和真菌（酵母菌）這3種，檢測本產(chǎn)品對不同構(gòu)造菌體的裂解及檢測能力。

2.1.2.1 大腸埃希氏菌

取濃度為1×108CFU/mL ATCC 25922新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度，從檢測管中取出棉簽，用移液槍準(zhǔn)確移取20μL菌液滴于棉簽頭上，等待30s，然后將棉簽插回檢測管內(nèi)并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP熒光檢測儀，等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進行線性分析，根據(jù)R2判斷其線性是否良好。

2.1.2.2 金黃色葡萄球菌

取濃度為4×108CFU/mL ATCC 6538新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度。從檢測管中取出棉簽，用移液槍準(zhǔn)確移取20μL菌液滴于棉簽頭上，等待30s，然后將棉簽插回檢測管內(nèi)并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進行線性分析，根據(jù)R2判斷其線性是否良好。

2.1.2.3 酵母菌

取5×106CFU/mL ATCC 10231新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度，從檢測管中取出棉簽，用移液槍準(zhǔn)確移取20μL菌液滴于棉簽頭上，等待30s，然后將棉簽插回檢測管內(nèi)并按下使其與底液接觸，將檢測管左右搖晃5～10s，充分混勻后，插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進行線性分析，根據(jù)R2判斷其線性是否良好。

2.2 重復(fù)性

用移液槍準(zhǔn)確移取20μL不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（1.77x10-6mol/L濃度梯度和1.77x10-8mol/L濃度梯度）滴于棉簽頭上，然后將棉簽插回拭子管內(nèi)并按下使其與底液接觸，左右搖晃5～10s，充分混勻后，將拭子插入ATP檢測儀，等待30s后開始檢測。重復(fù)測試10次，計算10次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于15%。

2.3 衰減率

測定儀器在5min內(nèi)的熒光值衰減率。選擇一個較高濃度ATP溶液（1.77x10-13mol/L）和一個較低濃度ATP溶液（1.77x10-15mol/L），各吸取20μL滴加至拭子棉簽上，測定反應(yīng)發(fā)生后5min內(nèi)的熒光衰減率，每隔一分鐘測定一次熒光值，衰減率應(yīng)不超過25%。

3 結(jié)果與分析

3.1靈敏度

3.1.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)品檢測靈敏度

本試驗選擇1.77×10-10～1.77×10-16mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液進行梯度實驗，測得的不同濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測值如表1。

由表1可以看出，在1.77×10-10～1.77×10-16mol/L濃度范圍內(nèi)，儀器測得的熒光值隨ATP濃度變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異，檢測值隨ATP濃度降低而減小。由圖1可知，在1.77×10-10～1.77×10-16mol/L濃度范圍內(nèi)，儀器所測得的熒光值不僅呈現(xiàn)出明顯的梯度差異，而且有較好的線性關(guān)系，線性方程為y=0.9589x+18.442（R?=0.9961）。所以，本系統(tǒng)可準(zhǔn)確檢測濃度在1.77×10-10～1.77×10-16mol/L范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)ATP樣品，最低檢測限為1.77×10-15mol/L。

3.1.2 菌體檢測靈敏度及線性

3.1.2.1 大腸埃希氏菌

大腸埃希氏菌是革蘭氏陰性菌，本系統(tǒng)對大腸埃希氏菌的檢測結(jié)果如下：

由表2可以看出，在2×106至2000CFU范圍內(nèi)，儀器測得的熒光值隨菌液量變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異，檢測值隨菌量降低而減小。圖2表明，在一定范圍內(nèi)，儀器測得的熒光值不僅有明顯的梯度差異，且有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.0062x-0.9009（R?=0.9719）。所以，本拭子可以準(zhǔn)確檢測CFU在2×106至2000范圍內(nèi)的大腸桿菌，最低檢測限為2000CFU。

3.1.2.2 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，本系統(tǒng)對金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果如表3。

由表3可以看出，在8×106至800CFU范圍內(nèi)，儀器測得的熒光值隨菌液量變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異，檢測值隨菌量降低而減小。圖3表明，在一定范圍內(nèi)，本儀器測得的熒光值與菌液濃度的線性關(guān)系較好，線性方程為y=1.0735x-2.079（R?=0.9969）。所以，本拭子可以準(zhǔn)確檢測CFU在8×106至800范圍內(nèi)的金黃色葡萄球菌，最低檢測限為800CFU。

3.1.2.3 酵母菌

酵母菌屬于真菌的一種，本系統(tǒng)對酵母菌的檢測結(jié)果如表4。

由表4可以看出，在105至10CFU范圍內(nèi)，本系統(tǒng)測得的熒光值隨菌液量變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異，檢測值隨菌量降低而減小。圖4表明，在一定范圍內(nèi)，本儀器測得的熒光值與酵母菌液濃度的線性關(guān)系較好，線性方程為y=0.9046x+1.8542（R?=0.9916）。所以，本拭子可以準(zhǔn)確檢測CFU在105至10CFU范圍內(nèi)的酵母菌，最低檢測限為10CFU。

3.2 重復(fù)性驗證結(jié)果

選取ATP 1.77×10-13mol/L梯度和ATP 1.77×10-15mol/L梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測試拭子重復(fù)性，檢測結(jié)果如表5。

由表5可以看出，在較高濃度ATP（1.77×10-13mol/L）情況下，檢測10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8%;在較低濃度ATP（1.77×10-15mol/L）情況下，檢測10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為13%，高濃度和低濃度ATP條件下的檢測重復(fù)性均小于15%。所以，本系統(tǒng)具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3.3 衰減率

使用ATP熒光法檢測潔凈度時，衰減率是一個重要指標(biāo)——在ATP熒光反應(yīng)中所生成的熒光容易發(fā)生降解，導(dǎo)致檢測的時效性和穩(wěn)定性都受到較大影響。本研究對待測拭子進行了衰減率檢測，結(jié)果詳見表6。

由表6可知，濃度為1.77×10-13mol/L的ATP溶液在檢測第6min時，熒光值相比較最高熒光值是92%;濃度為1.77×10-15mol/L的ATP溶液在檢測第6min時，熒光值相比較最高熒光值是106%。兩次試驗的衰減率均遠小于25%，說明本系統(tǒng)具有良好的抗衰減能力，滿足ATP檢測要求。

4 討論

本研究對一種基于ATP熒光反應(yīng)的潔凈度檢測系統(tǒng)的靈敏度、線性、重復(fù)性和衰減率進行了驗證，且驗證結(jié)果良好;該系統(tǒng)對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限為1.77×10-15mol/L，線性良好。該系統(tǒng)對菌液的檢出結(jié)果為：大腸埃希氏菌檢出限2000CFU、金黃色葡萄球菌檢出限800CFU、酵母菌檢出限10CFU，均線性良好。同時，這一系統(tǒng)的重復(fù)性良好，在高濃度ATP下，重復(fù)檢測10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為8%;低濃度ATP下，重復(fù)檢測10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為13%，均小于15%，滿足要求。此外，在6min內(nèi)，熒光衰減率沒有明顯變化。以上結(jié)果表明，該潔凈度檢測系統(tǒng)的基本性能可滿足環(huán)境潔凈度檢測的要求。

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