固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定飲料中9種人工合成著色劑

汪強(qiáng) 黃宇

摘 要：本文介紹了使用固相萃取-高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)技術(shù)來簡(jiǎn)便快捷地檢測(cè)飲料中檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅這9種人工合成著色劑含量的方法。樣品經(jīng)PWAX固相萃取柱凈化，采用串聯(lián)兩根Thermo BDS C18色譜柱（4.6×150mm，5μm），以甲醇和0.02mol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，DAD檢測(cè)波長為254nm，以保留時(shí)間和待測(cè)物的紫外吸收光譜進(jìn)行定性分析、外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，9種人工合成著色劑的線性范圍為0.5～50mg/L（r2>0.999），檢出限為0.11～0.39mg/kg，平均回收率為81.5%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.23%～2.24%。結(jié)論為，該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)飲料中9種合成著色劑的同時(shí)檢測(cè)，具有快捷、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：固相萃取? 高效液相? 人工合成著色劑? 飲料

在現(xiàn)代食品工業(yè)中，各種食品添加劑被頻繁使用。其中，人工合成著色劑具有色澤鮮艷、著色能力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，因而在各式飲料、糕點(diǎn)等的配料表中頻頻“曝光”。殊不知，五彩斑斕的人工合成著色劑主要以苯、甲苯、萘等芳香族化工產(chǎn)品為主要原料，經(jīng)過磺化、鹵化、偶氮化等有機(jī)反應(yīng)合成而來，過量攝入人工合成著色劑會(huì)對(duì)人體造成損害[1-3]。因此，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）[4]中對(duì)檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅這9種人工合成著色劑的使用范圍及最大使用量作出了明確規(guī)定。為了避免企業(yè)超量使用或超范圍使用人工合成著色劑，故需要通過簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)手段對(duì)市場(chǎng)上流通的產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管。

目前，人工合成著色劑的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法等[5-9]。其中，高效液相色譜法由于儀器保有量大、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。GB 5009.35-2016[10]、GB 5009.141-2016[11]及SN/T 1743-2006[12]中規(guī)定的食品中合成著色劑檢測(cè)方法均為高效液相色譜法，但其前處理方法都是聚酰胺吸附法或液-液分配法——操作復(fù)雜、消耗試劑多。因此，本試驗(yàn)采用PWAX固相萃取小柱[13]對(duì)飲料進(jìn)行前處理，使用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器于254nm波長下同時(shí)測(cè)定檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅這9種人工合成著色劑。該方法能夠顯著提高檢測(cè)效率，降低成本。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀（配DAD檢測(cè)器），島津（日本）;24位固相萃取裝置，安譜（中國）;ME204/02型萬分之一天平，梅特勒-托利多（瑞士）;12位N-EVAP 5085型氮吹儀，organomation（美國）;Arium-Pro型純水系統(tǒng)，賽多利斯（德國）;S-700B型多參數(shù)測(cè)試儀，梅特勒-托利多（瑞士），Cleanert PWAX（150mg/6mL），Agela（中國）;0.45μm水洗微孔濾膜，CNW（德國），HC-3018型離心機(jī)，中科中佳（中國）。

1.1.2 試劑

檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅這9種著色劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供，并于20±4℃下保存。

甲醇（色譜純），TEDIA;乙酸銨（色譜純），阿拉丁;氨水（分析純）、檸檬酸（分析純）、硫酸鋅（分析純），國藥;實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

乙酸銨溶液（0.02mol/L）：稱取1.54g乙酸銨，加水溶解并稀釋至1000mL。

檸檬酸溶液（200g/L）：稱取20g檸檬酸，加水定容至100mL溶解，混勻。

硫酸鋅溶液（120g/L）：稱取12g硫酸鋅，加水定容至100mL溶解，混勻。

2%氨化甲醇：量取2mL氨水，加甲醇定容至100mL，混勻。

水（pH值6.0）：水加檸檬酸溶液調(diào)節(jié)至pH值6.0。

檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液（1mg/mL）：分別稱取適量的9種著色劑置于燒杯中，用少許水（pH值6.0）溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，并用水（pH值6.0）定容至刻度，混勻。

1.2 色譜條件

兩根串聯(lián)的Thermo BDS C18色譜柱（4.6×150mm，5μm）;柱溫：35℃;流量：1.0mL/min;進(jìn)樣量：50μL;檢測(cè)波長：254nm;流動(dòng)相A：0.02mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B：甲醇;梯度洗脫程序見表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不含蛋白質(zhì)的樣品

稱取10g樣品放入100mL燒杯中（含二氧化碳的樣品超聲去除二氧化碳），用檸檬酸溶解調(diào)節(jié)pH值至6.0，然后加入到分別用8mL甲醇、8mL水（pH值6.0）進(jìn)行活化的PWAX小柱中。燒杯用適量的水沖洗后一起加入至PWAX小柱，再用6mL水（pH值6.0）、6mL甲醇淋洗，之后通入空氣吹干小柱6min。最后，用8mL 2%氨化甲醇洗脫并接收，收集液于50℃氮?dú)獯蹈桑?mL水（pH值6.0）定容，過0.45μm水系微孔濾膜，待測(cè)。

1.3.2 含蛋白質(zhì)的樣品

稱取10g樣品放入50mL離心管中，加入5mL硫酸鋅溶液（120g/L），用檸檬酸溶解調(diào)節(jié)pH值至6.0，在10000r/min下離心5min，取上清液于干凈的50mL離心管中。殘?jiān)屑尤?mL水（pH值6.0）渦旋振蕩提取5min，在10000r/min下離心，取上清液合并至上述干凈的50mL離心管中。將合并后的上清液加入至分別用8mL甲醇、8mL水（pH值6.0）進(jìn)行活化的PWAX小柱中，再用6mL水（pH值6.0）、6mL甲醇淋洗，之后通入空氣吹干小柱6min。最后，用8mL 2%氨化甲醇洗脫并接收，收集液于50℃氮?dú)獯蹈桑?mL水（pH值6.0）定容，過0.45μm水系微孔濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化方法的改進(jìn)

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35-2016）[10]規(guī)定，同時(shí)測(cè)定赤蘚紅含量時(shí)需要使用液-液分配法，但該方法不僅操作步驟繁瑣，且使用的試劑量較多、對(duì)環(huán)境危害大。所以本文選用PWAX小柱代替原有國標(biāo)的測(cè)試方法，不僅簡(jiǎn)化了操作步驟，還減少了污染，更可同時(shí)檢測(cè)9種著色劑。

2.2 流動(dòng)相的改進(jìn)

流動(dòng)相的選擇參考國標(biāo)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35-2016）[10]方法，采用甲醇和0.02mol/L乙酸銨的混合體系，優(yōu)化梯度洗脫條件以縮短9種著色劑的檢測(cè)時(shí)間，并獲得了較好的分離效果，梯度洗脫程序見表1。

2.3 色譜柱的改進(jìn)

當(dāng)前，市面上C18色譜柱的常見規(guī)格為（4.6×150mm，5μm）和（4.6×250mm，5μm）兩種。在優(yōu)化后的色譜條件下，對(duì)比市面上兩種常見規(guī)格C18色譜柱的分離效果發(fā)現(xiàn)，檸檬黃和新紅這兩種著色劑的分離效果并不理想。為了能將這兩種著色劑完全分離，于是根據(jù)增加柱長可以提高分離效果的原理，將兩根規(guī)格（4.6mm×150mm，5μm）的C18色譜柱通過管路連接起來形成一根規(guī)格類似為（4.6mm×300mm，5μm）的C18色譜柱，再使用優(yōu)化后的色譜條件分離9種著色劑，發(fā)現(xiàn)9種色素均能夠完全分離，見圖1。因此，選擇串聯(lián)相同規(guī)格色譜柱作為分離目標(biāo)化合物的新方法。

2.4 檢測(cè)波長的選擇

在檢測(cè)多種著色劑時(shí)，很多文章報(bào)道是通過在不同著色劑的出峰時(shí)間段內(nèi)設(shè)置其最大吸收波長的方式來進(jìn)行檢測(cè)。這種方式雖然可以增加檢測(cè)的靈敏度，但由于不斷的改變波長造成在檢測(cè)低濃度時(shí)基線波動(dòng)較大，使檢測(cè)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此，本文選擇使用254nm作為9種著色劑的檢測(cè)波長。此外，為了提升檢測(cè)靈敏度，本文通過增加進(jìn)樣量的方式來改善這一問題。

2.5 工作曲線和檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定，以9種著色劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明，9種著色劑的質(zhì)量濃度均在0.5～50mg/L內(nèi)，與其對(duì)應(yīng)的峰面積之間呈線性關(guān)系，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。

將混標(biāo)添加在空白基質(zhì)樣品中，在相同條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，按照3倍信噪比考察了9種著色劑的檢出限，具體結(jié)果見表2。

2.6 回收試驗(yàn)

分別稱取可樂、葡萄汁、橙汁、咖啡這4種陰性樣品10.00g，按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行不同濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每一個(gè)濃度平行進(jìn)行6次試驗(yàn)，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

3 結(jié)果與討論

本文建立了采用PWAX固相萃取小柱對(duì)飲料進(jìn)行前處理，使用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器于254nm波長下同時(shí)測(cè)定檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、赤蘚紅這9種人工合成著色劑的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、基體干擾小，優(yōu)化后的色譜條件出峰快、峰形好，分離度符合要求，適合飲料產(chǎn)品中著色劑的定性和定量分析。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李幫銳，馮家力，潘振球，等. 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定飲料中的人工合成色素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17（4）：579-580.

[2] 張學(xué)忠，牛之瑞，馮雷，等.高效液相法測(cè)定飲料中合成著色劑預(yù)處理方法的比較[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（2）：94-96.

[3] 朱海英，黃萬琪. 食品安全法背景下合成色素的問題及對(duì)策[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（8）：1259?1261.

[4] 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）[S].

[5] 譚慧，王勝，朱其名. 高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定熟肉制品中的10種合成色素[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24（16）：2334?2336.

[6] 伊雄海，鄧曉軍，楊惠琴，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中的多 種易濫用著色劑[J]. 色譜，2011，29（11）：1062?1069.

[7] 龍巍然，王興益，史振雨，等. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜同時(shí)測(cè)定食品中13種人工合成色素[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31（9）：1100–1104.

[8] Andrade FI，F(xiàn)lorindo GMI，Pinto VIG， et al. Determination of synthetic food dyes in commercial soft drinks by TLC and ion-pair HPLC [J]. Food Chem， 2014， 157：193?198.

[9] 林慧，徐春祥，劉成志，等. 液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜快速篩查食品中違禁著色劑[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（4）：1389?1396.

[10]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35-2016）[S].

[11]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中誘惑紅的測(cè)定》（GB 5009.141-2016）[S].

[12]《食品中誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃的含量檢測(cè) 高效液相色譜法》（SN/T 1743-2006）[S].

[13] 胡貝，李麗霞，劉紅等. SPE-HPLC法測(cè)定食品中8種合成著色劑[J]. 食品工業(yè)，2020，41（1）：298-301.