褪黑素對(duì)雄性動(dòng)物生殖機(jī)能影響的研究進(jìn)展

申艷超,張子敬，楊國峰，張士坤，王二耀，王迎港，黃永震，王獻(xiàn)偉，白獻(xiàn)曉，徐照學(xué)，王三虎，張 偉

(1.河南科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊陵 712100；4.河南省畜牧總站，河南 鄭州 450008)

褪黑素(Melatonin，MT)，又稱為抑黑素、松果腺素，1958年從牛的松果腺中提取出來。褪黑素廣泛參與機(jī)體的眾多生理過程，具有重要的生物學(xué)功能，與節(jié)律性調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、清除自由基、抗氧化和延緩衰老等有密切關(guān)系[1]。目前許多研究已證實(shí)，MT在雄性動(dòng)物生殖過程中具有廣泛作用，可提高精子頂體完整率、質(zhì)膜完整率和線粒體活性，抑制精子凋亡，從而改善精液品質(zhì)[2]。鑒于此，綜述了近年來國內(nèi)外有關(guān)褪黑素在雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中的分布、作用研究進(jìn)展，以期為褪黑素在雄性動(dòng)物生產(chǎn)中更廣泛的運(yùn)用提供參考。

1 褪黑素概述

1.1 褪黑素的分子結(jié)構(gòu)

褪黑素的化學(xué)名稱為N-乙?；?5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，是色氨酸的衍生物；分子式為C13N2H16O2，相對(duì)分子質(zhì)量為232.28，熔點(diǎn)116～118 ℃[3-4]。在動(dòng)物體內(nèi)，褪黑素主要是由松果腺合成和分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有高度親脂性和部分親水性，具有高度彌散穿透能力，可彌散穿透各種生理屏障，高效清除細(xì)胞內(nèi)自由基以及在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核中發(fā)揮強(qiáng)有力的抗氧化作用[1-2]。

1.2 褪黑素在雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的分布

脊椎動(dòng)物的松果體、視網(wǎng)膜、皮膚、血液、胃腸道等均可合成褪黑素[5]。此外許多研究證實(shí)，褪黑素在諸如小鼠、大鼠、牛、山羊、綿羊、鹿、駱駝、禽類等多種雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[6-7]。同一物種不同個(gè)體及不同物種體內(nèi)的褪黑素分泌量與季節(jié)和光照因素密切聯(lián)系，具有明顯的晝夜節(jié)律性變化。夜間褪黑素的分泌量明顯高于白天，短日照明顯高于長日照。不同個(gè)體之間夜間褪黑素分泌量差別很大，不同物種間分泌量也不同[8]。同一物種不同品種之間也具有差別，如采用放射免疫分析法(RIA)測(cè)定濟(jì)寧青山羊(高繁殖力)和沂蒙黑山羊(低繁殖力)不同季節(jié)血漿中褪黑素分泌變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)除冬季外的其他季節(jié)，濟(jì)寧青山羊在各個(gè)采樣點(diǎn)的褪黑素濃度均高于沂蒙黑山羊，并且夜間褪黑素的平均分泌量均極顯著高于沂蒙黑山羊[9]。季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物血液中的褪黑素濃度變化與季節(jié)有關(guān)，亞熱帶氣候條件下飼養(yǎng)的季節(jié)性繁殖動(dòng)物雄鹿，繁殖過程中不同季節(jié)睪丸中精子運(yùn)動(dòng)能力、精子密度、精子質(zhì)膜完整率等質(zhì)量指標(biāo)有顯著的差異，而且血液中褪黑素濃度有明顯的季節(jié)性差異，揭示環(huán)境溫度-濕度指數(shù)(THI)對(duì)雄性動(dòng)物體內(nèi)褪黑素的濃度及生殖功能具有重要影響[10]。

1.3 褪黑素的合成代謝

在動(dòng)物體內(nèi)，色氨酸在酶的催化作用下合成褪黑素：松果腺細(xì)胞攝入色氨酸后，松果體在光神經(jīng)的控制下，經(jīng)過色氨酸羥化酶的作用生成 5-羥色氨酸；5-羥色氨酸在芳香 L-氨基酸脫羧酶作用下脫羧形成5-羥色胺；5-羥色胺再經(jīng)N-乙酰、羥吲哚一氧甲基轉(zhuǎn)移酶的催化生成5-甲氧基-N-乙酰色胺，即合成褪黑素。芳烷基胺-N-乙?；D(zhuǎn)移酶(AA-NAT)活性決定著褪黑素的合成和分泌節(jié)律，是褪黑素生物合成的關(guān)鍵酶之一，使5-羥色胺轉(zhuǎn)變成乙酰羥色胺[6]。不同物種AA-NAT基因同源性很高，人類AA-NAT基因全長2.5 kb，位于染色體17q25處，有4個(gè)外顯子。其中，外顯子1未被翻譯，其他3個(gè)(238、155、453 bp)可翻譯成蛋白質(zhì)。偶蹄類動(dòng)物AA-NAT基因相似性很高，如樂至黑山羊與綿羊、普通牛同源性分別為97.6%和95.51%，而且AA-NAT基因的多態(tài)性與雄性動(dòng)物繁殖具有相關(guān)性[6，11-12]。褪黑素在機(jī)體中經(jīng)典的降解途徑是在肝臟中，通過細(xì)胞色素P450酶亞型的6-羥基化產(chǎn)生6-羥基褪黑素，催化褪黑素中的氧去甲基化形成N-乙酰-血清素(N-乙酰-5-羥色胺)，然后被硫酸化或葡萄糖醛酸化，其產(chǎn)物通過尿液排泄出來。此外，吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、辣根過氧化物酶等將褪黑素轉(zhuǎn)化為N1-乙?；?N2-甲?；?5-甲氧基犬脲酰胺(AFMK)。AFMK進(jìn)一步通過芳胺甲酰胺酶或過氧化氫酶作用轉(zhuǎn)化為N1-乙酰基-5-甲氧基氨基脲(AMK)[13]。

1.4 褪黑素的作用機(jī)制和特點(diǎn)

褪黑素發(fā)揮生物學(xué)作用依賴于其特異性受體，褪黑素受體均為膜表面受體，分別為褪黑素膜受體1(Melatonin receptor 1,MT1)和褪黑素膜受體2(Melatonin receptor 2,MT2)等膜表面受體，以及位于核內(nèi)的視網(wǎng)膜酸受體相關(guān)孤兒受體α(Retinoid related orphan nuclear hormone receptor,RORα)[7]。上述3種受體在多種家畜和家禽的神經(jīng)系統(tǒng)(如大腦、下丘腦、中腦、嗅球和視交叉等腦區(qū))和周邊組織(如心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃腸、胸腺、肌肉等組織)廣泛表達(dá)[14-15]。在雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的各種組織器官，如睪丸中的精原細(xì)胞、支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、未成熟的精子[16-18]和附睪中的附睪上皮細(xì)胞、成熟精子[6]，精囊腺和輸精管中等也廣泛分布[19]。褪黑素對(duì)機(jī)體的作用具有低毒性、無依賴性、內(nèi)源性和小劑量等特點(diǎn)[5]，但褪黑素的生物學(xué)功能與其表達(dá)量及所在組織的生理功能密切相關(guān)[20]。3月齡山羊睪丸中MT1和MT2主要分布在原始生殖細(xì)胞和睪丸間質(zhì)細(xì)胞中并且高表達(dá)，RORα在支持細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞中低表達(dá)，并且僅在間質(zhì)細(xì)胞的核周區(qū)高表達(dá)。進(jìn)一步分析3月齡與10月齡的山羊睪丸，MT1和MT2表達(dá)量隨著年齡增加而減少，RORα的mRNA表達(dá)則相反呈現(xiàn)增加趨勢(shì)[21]。MT1全長350個(gè)氨基酸，MT2全長363個(gè)氨基酸，與MT1有60%的同源性，MT1和MT2通過與G蛋白偶聯(lián)參與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[22]。依據(jù)細(xì)胞種類和生理功能的不同，MT1可以進(jìn)一步活化增加蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)、C-Jun腸溶激酶(C-JNK)。MT2則可以抑制cAMP和JNK[6，23]。RORα包括3個(gè)亞型(A、B、C)和A亞型的4個(gè)接頭類型，這些核受體通過依賴性轉(zhuǎn)錄因子在動(dòng)物生殖細(xì)胞增殖、分化過程中發(fā)揮重要作用[7]。

2 褪黑素多方面影響雄性動(dòng)物的生殖機(jī)能

2.1 雄性生殖器官發(fā)育

褪黑素作用于下丘腦-垂體-性腺軸來實(shí)現(xiàn)對(duì)雄性動(dòng)物生殖機(jī)能的調(diào)控作用。光照是影響褪黑素產(chǎn)量的主要環(huán)境因子，在自然條件下，隨季節(jié)變化而發(fā)生的晝長變化，是啟動(dòng)繁殖周期的重要因子[24]。尤其是對(duì)于季節(jié)性繁殖動(dòng)物，利用人工光照改變動(dòng)物體內(nèi)褪黑素的分泌進(jìn)而促使某些哺乳動(dòng)物的繁殖季節(jié)提前，如對(duì)乏情動(dòng)物在秋冬季補(bǔ)充光照，或全部進(jìn)行人工“全日照”模擬夏季光周期[25]。有研究報(bào)道指出，褪黑素處理可以使公羊初情期提前，而乏情公羊必須經(jīng)受一段時(shí)間的長日照后，皮下埋植褪黑素才能引起睪丸重新發(fā)育[26]。當(dāng)雄性動(dòng)物進(jìn)入老年期后，睪丸中凋亡細(xì)胞增多，質(zhì)量下降，但是采用褪黑素處理衰老期雄性大鼠后，睪丸質(zhì)量下降緩慢，睪丸分泌睪酮水平顯著升高[27]。生殖器官發(fā)育不良的雄性動(dòng)物采用褪黑素腹腔注射治療后與正常雄性動(dòng)物相比，其睪丸發(fā)育包括睪丸質(zhì)量、睪丸指數(shù)無顯著差異，進(jìn)一步檢測(cè)不同處理組精子的密度、精子頂體完整率和精子質(zhì)膜完整率，均無顯著差異[28]。此外，褪黑素作為一種親脂性、易通過細(xì)胞膜的親水性化合物，在睪丸發(fā)育中也是一種有效的抗氧化劑，有助于睪丸癌癥治療、免受環(huán)境的氧化損傷和其他有毒分子的副作用[27]。綜上，褪黑素對(duì)雄性生殖器官發(fā)育特別是受到環(huán)境氧化應(yīng)激損傷時(shí)，具有良好的保護(hù)作用，有利于畜牧生產(chǎn)。

2.2 精子發(fā)生

精子發(fā)生是一個(gè)有序復(fù)雜的細(xì)胞分化過程，精原細(xì)胞分化為原始精母細(xì)胞，最后形成初級(jí)精母細(xì)胞。褪黑素和褪黑素受體在精子發(fā)生的各級(jí)細(xì)胞中普遍存在，在動(dòng)物受精階段褪黑素及其受體的表達(dá)水平最高，具有直接調(diào)節(jié)精子功能的生理作用[29]。將發(fā)情期前小鼠睪丸暴露于雙酚A(BPA)或鄰苯二甲酸二己酯(DEHP)中，會(huì)損害精子發(fā)生，并干擾精原細(xì)胞的活性和減數(shù)分裂。當(dāng)采用褪黑素處理后，通過維持睪丸中精原干細(xì)胞和減數(shù)分裂細(xì)胞正常的H3K9二甲基化從而保護(hù)睪丸免受上述2種內(nèi)分泌干擾物的影響[30]。有研究發(fā)現(xiàn)，在山羊睪丸精原干細(xì)胞體外分化系統(tǒng)中，加入10-7mol/L褪黑素可增加其核內(nèi)受體RORα的表達(dá)，并顯著提高單倍體細(xì)胞的分化和形成精子的效率。但采用RORα激動(dòng)劑(CGP52608)處理后，可顯著提高睪酮濃度和GATA結(jié)合因子4(GATA-4)的表達(dá)。揭示褪黑素及其受體在雄性動(dòng)物精子發(fā)生過程中和精原干細(xì)胞的分化培養(yǎng)中起到關(guān)鍵作用[21]。

2.3 精子質(zhì)量與運(yùn)動(dòng)

褪黑素能清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，且能激活多種抗氧化系統(tǒng)，對(duì)精子膜的脂質(zhì)過氧化損傷有保護(hù)作用，延長精子存活時(shí)間，提高凍后精子質(zhì)量[31]。精子線粒體是提供精子運(yùn)動(dòng)的能量源泉，其結(jié)構(gòu)與功能的改變，必然影響到精子的運(yùn)動(dòng)能力[32]。體外精子熱處理試驗(yàn)表明，與正常處理組相比，培養(yǎng)液中含有褪黑素組精子的存活率和直線運(yùn)動(dòng)的比例顯著增加。褪黑素的強(qiáng)抗氧化能力，具有保護(hù)精子線粒體對(duì)抗ROS 攻擊的作用，從而增加線粒體的活性[33]。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致精子DNA損傷，進(jìn)而導(dǎo)致其受精能力下降。另外，采用1 mmol/L褪黑素預(yù)培養(yǎng)后的精子與未處理精子相比，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，并使精子細(xì)胞中的DNA致密化，防止正常精子中的DNA斷裂[34]。也有報(bào)道指出，采集非繁殖季節(jié)經(jīng)不同濃度褪黑素處理公綿羊精液，與繁殖季節(jié)時(shí)采集到的精液相比，精子的運(yùn)動(dòng)能力、存活率等沒有顯著差異[35]。在非繁殖季節(jié)，當(dāng)采用褪黑素皮下植入處理摩拉水牛后，精子直線運(yùn)動(dòng)的比例、精子活力顯著升高，精子異常運(yùn)動(dòng)率顯著下降。此外，精漿總蛋白、白蛋白及膽固醇含量顯著增加，而天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性降低，成功提高了熱帶氣候下水牛非繁殖期的精液質(zhì)量[36]。

2.4 精子超活化和受精作用

精子在雌性生殖道或合適的條件下完成獲能才能順利受精，在獲能的最后階段，精子運(yùn)動(dòng)時(shí)頭部呈“8”字形運(yùn)動(dòng)，稱為精子超活化，并產(chǎn)生推進(jìn)力促進(jìn)精子穿越透明帶[35]。目前有研究報(bào)道，添加褪黑素處理倉鼠精子后，精子超活化能力顯著增強(qiáng)，而且褪黑素通過其受體MT1影響精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+和NO發(fā)生作用[37]。進(jìn)一步研究則證實(shí)，褪黑素通過抑制eNOS活性，減少NO產(chǎn)生，進(jìn)而消除自由基引發(fā)的損傷，從而影響精子的超活化[38]。但是褪黑素增強(qiáng)精子超活化的作用可以被17β-雌二醇通過雌激素受體(ER)的非基因組調(diào)節(jié)抑制[39]。在非繁殖季節(jié)，采用褪黑素處理公綿羊后，采集其精液，與繁殖季節(jié)相比，精子的運(yùn)動(dòng)能力、存活率等沒有顯著差異；并且發(fā)現(xiàn)100 pmol/L褪黑素處理后的精子在體外受精后，卵母細(xì)胞受精率、受精卵卵裂率則顯著增加[35]。在非繁殖季節(jié)，當(dāng)成年公羊采用皮下植入褪黑素處理90 d后，與對(duì)照組相比，褪黑素處理組顯著提高了公羊精清中谷氨酸、乙酰肉堿、膽堿和精氨酸濃度，而且進(jìn)一步檢測(cè)處理組精子的體外受精能力，發(fā)現(xiàn)其形成囊胚數(shù)顯著增加，受精能力增強(qiáng)[40]。

2.5 精液品質(zhì)與保存

褪黑素一方面可提高精子頂體完整率、發(fā)育能力和線粒體活性，抑制精子凋亡；另一方面，褪黑素可以提高雄性動(dòng)物精清中谷氨酸、乙酰肉堿、膽堿和精氨酸等有利于精子保存的物質(zhì)濃度,從而改善精液品質(zhì)。目前在小鼠、大鼠[41]、牛[2]、綿羊[42]、山羊[21]、雄鹿[43]等多種動(dòng)物中均有報(bào)道，添加適宜濃度褪黑素能夠抑制精液保存中精子細(xì)胞的氧化性損傷，顯著提高精液保存質(zhì)量。在實(shí)際生產(chǎn)中，褪黑素作為抗氧化劑已廣泛運(yùn)用于動(dòng)物精液體外保存，如豬、羊精液的低溫保存[44]。

2.6 雄性生殖內(nèi)分泌

松果腺分泌的褪黑素可以與垂體或下丘腦上的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)下丘腦激素的分泌，進(jìn)而作用于性腺，實(shí)現(xiàn)對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，引起生殖激素的分泌發(fā)生變化。在某些物種中(如綿羊)，褪黑素通過改變促性腺激素釋放激素(GnRH)誘導(dǎo)的卵泡刺激素(FSH)和促黃體生成素(LH)的分泌來間接影響血液中睪酮的濃度。對(duì)綿羊進(jìn)行MT處理，第7天血漿中孕酮含量與處理前差別達(dá)到極顯著水平，第10天血漿中孕酮含量差別達(dá)到顯著水平，說明褪黑素對(duì)孕酮的分泌有促進(jìn)作用[42，45]。

雄激素主要由睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌，腎上腺皮質(zhì)、卵巢和胚胎也可分泌少量雄激素。雄激素種類繁多，在動(dòng)物體內(nèi)主要以睪酮為主[46]。在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞系中，褪黑素通過下調(diào)GATA-4表達(dá)進(jìn)而作用于類固醇合成快速調(diào)節(jié)蛋白從而抑制睪酮分泌[47]。在山羊精原干細(xì)胞體外分化培養(yǎng)系統(tǒng)中，褪黑素通過其核內(nèi)受體RORα增強(qiáng)GATA-4的表達(dá)促進(jìn)睪酮的生成[21]。褪黑素還能促進(jìn)共培養(yǎng)綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞睪酮的分泌，增加干細(xì)胞因子表達(dá)，并通過MT1促進(jìn)胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的表達(dá)，減少了支持細(xì)胞中的雌激素合成[48]。此外，褪黑素可以促進(jìn)綿羊雄性激素受體的表達(dá)以及雄激素的分泌[46]，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，褪黑素通過啟動(dòng)子區(qū)域抑制芳香化酶基因表達(dá)，從而抑制芳香化酶的活性和抑制雌激素生物合成，但具體的機(jī)制需要深入研究[49]。

2.7 雄性生殖疾病治療

雄性動(dòng)物常見生殖疾病主要有隱睪癥、睪丸扭轉(zhuǎn)、睪丸炎、附睪炎、陰囊炎、精囊腺炎等，導(dǎo)致生精機(jī)能障礙、精液品質(zhì)不良、受精障礙等，影響畜牧業(yè)生產(chǎn)。目前有關(guān)褪黑素與雄性動(dòng)物生殖疾病關(guān)系的報(bào)道較少，隱睪癥指由于各種不確切病因一側(cè)或雙側(cè)睪丸未能從腹膜后下降至同側(cè)陰囊內(nèi)。有研究報(bào)道指出，在大鼠隱睪(單側(cè)或雙側(cè))模型中，無論單側(cè)或雙側(cè)隱睪大鼠與正常大鼠相比，其睪丸質(zhì)量顯著下降。對(duì)單側(cè)(雙側(cè))隱睪大鼠注射0.7 mg/kg劑量的褪黑素后，與未處理單側(cè)(雙側(cè))隱睪大鼠相比，其睪丸質(zhì)量顯著增加，精子密度、精子運(yùn)動(dòng)能力顯著增強(qiáng)，說明褪黑素處理具有緩和動(dòng)物隱睪危害的作用[50]。褪黑素(20、50、100 mg/kg)處理缺血性睪丸扭轉(zhuǎn)大鼠后，與睪丸扭轉(zhuǎn)組相比，透射電鏡觀察扭轉(zhuǎn)組睪丸中有大量空泡和殘留細(xì)胞器退化產(chǎn)生的顆粒，精原細(xì)胞胞漿中的局部空隙等損傷病理，而褪黑激素處理后，特別是劑量為100 mg/kg的處理，睪丸病理損傷狀態(tài)顯著減輕，說明褪黑素可以用來預(yù)防睪丸扭轉(zhuǎn)過程中的缺血或再灌注損傷[41]。褪黑素調(diào)節(jié)多種生理功能，對(duì)免疫系統(tǒng)有多效性作用，具有抗炎特性[51]。

3 小結(jié)

褪黑素及其受體在雄性動(dòng)物生殖器官中廣泛分布，在雄性動(dòng)物生殖機(jī)能諸多方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用,如雄性動(dòng)物生殖器官發(fā)育、精子發(fā)生、精子質(zhì)量與運(yùn)動(dòng)、精液品質(zhì)與保存、雄性生殖內(nèi)分泌以及雄性生殖疾病治療等。隨著研究深入，褪黑素的作用機(jī)制更加完善，可為畜牧生產(chǎn)實(shí)踐中褪黑素的應(yīng)用提供廣泛理論指導(dǎo)。