番茄灰霉病高效內(nèi)生拮抗細菌的篩選與定殖特性

高振峰,李 娜,張曉宇,韓巨才

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所,山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801；3.今日農(nóng)業(yè)雜志社,山西 太原 030006)

番茄灰霉病害是一種由灰葡萄孢病原(Botrytiscinerea)引起的世界性真菌病害，不僅可在田間危害，而且病原分生孢子耐低溫能力強，在番茄采后低溫貯藏期間亦可形成暴發(fā)，對番茄采前生長、發(fā)育和品質(zhì)以及采后貯藏保鮮均具有重要影響[1-3]。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中該類病害防治仍以化學(xué)藥劑為主。近年來由于化學(xué)農(nóng)藥不合理使用導(dǎo)致病原菌抗藥性增強[4-5]、農(nóng)藥殘留[6]、環(huán)境污染[7-8]和生態(tài)失衡[9]，給后期防治帶來困難，也不利于農(nóng)藥行業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展，給我國農(nóng)產(chǎn)品安全和人類健康帶來威脅，因此，新型、綠色農(nóng)藥產(chǎn)品開發(fā)成為目前植物保護領(lǐng)域的研究熱點之一。

植物內(nèi)生拮抗細菌作為一類不同于根際抗病微生物的特殊微生物，可在宿主體內(nèi)與宿主和諧共生而不引起明顯癥狀，所處環(huán)境穩(wěn)定，營養(yǎng)來源可靠、豐富，具有同其他抗病微生物相似的抗菌物質(zhì)種類、作用方式多樣、抗菌譜廣和不易產(chǎn)生抗藥性等特點。部分內(nèi)生細菌在侵染宿主根系進入宿主植物體內(nèi)之前，還可在土壤中穩(wěn)定定殖，對一些土傳病害防治具有重要意義，是生物農(nóng)藥優(yōu)秀開發(fā)源之一[10-12]。因此，近年來人們圍繞內(nèi)生拮抗細菌進行了大量研究，且已從番茄[13-14]、抱莖苦荬菜[15]、梓樹[16]、地膚[17]和獨角蓮塊莖[18]等植物體內(nèi)分離到對B.cinerea具有良好抑制作用的內(nèi)生細菌，說明內(nèi)生細菌在該病害防治中具有良好應(yīng)用潛力。然而相關(guān)研究仍存在一些局限性：研究數(shù)量同其他抗病微生物相比較少；抗病研究以室內(nèi)測定居多，田間測定較少；抗病菌株篩選以室內(nèi)離體篩選居多，田間篩選較少；部分菌株雖可在來源宿主中內(nèi)生，但并未有證據(jù)表明亦可在番茄體內(nèi)內(nèi)生。

鑒于此，以植物內(nèi)生細菌防治番茄灰霉病害研究為核心內(nèi)容，采用平板對峙、利福平抗性標(biāo)記與田間試驗相結(jié)合的方法，對前期從梓樹、花椒、番茄、抱莖苦荬菜和酸棗等植物中分離到的58株植物內(nèi)生拮抗細菌的抑菌活性、定殖特性和田間防效進行測定，篩選對番茄灰霉病菌具有良好拮抗效果且可在番茄體內(nèi)良好定殖的內(nèi)生細菌。在此基礎(chǔ)上對其抗真菌譜及分類地位進行研究，為后期生物菌劑和菌肥的開發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

1.1.1 內(nèi)生細菌 菌株編號及來源見表1。58株菌株均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室保存(-80 ℃)并提供。

1.1.2 植物病原真菌 番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、蘋果腐爛病菌(Valsamali)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminerum)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.capsicum)、梨黑斑病菌(Alternariaalternata)、桃褐腐病菌(Moniliniafructicola)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、菜豆菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)和胡蘿卜腐爛病菌(Ceratocystisfimbriata)均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)實驗室保存并提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 10 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL，pH值自然；NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0；BPY培養(yǎng)液：蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、牛肉浸膏5 g、葡萄糖5 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.3 菌種活化

1.3.1 內(nèi)生細菌的活化 采用接種環(huán)挑取-80 ℃甘油法保存的各內(nèi)生細菌1環(huán)，于新鮮NA平板劃線，并于26 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)試驗。

1.3.2 植物病原真菌的活化 將供試植物病原真菌于試驗開始前均接種至新鮮的PDA平板，26 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后用于后續(xù)試驗。

1.4 拮抗細菌的篩選

以番茄灰霉病菌為靶標(biāo)，參照謝宗華等[19]的平板對峙法(略作修改)對1.3中活化后內(nèi)生細菌的拮抗效果進行測定。在超凈工作臺中于每培養(yǎng)皿(直徑為90 mm)中倒入PDA 培養(yǎng)基15 mL，完全凝固后，用直徑為5 mm的打孔器打取活化后的各植物病原真菌菌塊，并用接種針接種至PDA平板中央。

表1 內(nèi)生細菌編號及來源Tab.1 Number and isolation source of all endophytic bacteria

隨后再用接種環(huán)挑取各內(nèi)生細菌于距離植物病原真菌2 cm處進行接種，以不接種內(nèi)生細菌為對照，于26 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后參照PRABAVATHY等[20]的方法計算各處理抑菌率。各處理和試驗均重復(fù)3次。

1.5 內(nèi)生細菌定殖特性研究

采用抗生素標(biāo)記法對1.4中具有較好抑菌效果的內(nèi)生細菌的定殖特性進行測定。

1.5.1 利福平(Rif)抗性菌株誘導(dǎo) 采用濃度遞增的抗性誘導(dǎo)法對菌株的利福平抗性進行誘導(dǎo)，使菌株的利福平抗性達300 μg/mL。利福平抗性誘導(dǎo)質(zhì)量濃度梯度：0.5、1、2、4、8、15、30、60、120、200、300 μg/mL。各菌株在每級利福平質(zhì)量濃度下均可正常生長后，再轉(zhuǎn)移至下級質(zhì)量濃度進行誘導(dǎo)，直至菌株可在300 μg/mL利福平質(zhì)量濃度下正常生長為止。

1.5.2 利福平抗性遺傳穩(wěn)定性測定 為明確各菌株對利福平抗性的遺傳穩(wěn)定性，在利福平抗性誘導(dǎo)結(jié)束后，采用劃線法將利福平抗性菌株轉(zhuǎn)接至不含利福平的NA平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接5代后，再回接至含利福平質(zhì)量濃度為300 μg/mL的NA平板上檢測其遺傳穩(wěn)定性。正常生長的細菌鑒定為陽性，反之為陰性。

1.5.3 利福平抗性菌株抑菌活性測定 為檢測利福平抗性誘導(dǎo)過程中菌株抗菌活性是否出現(xiàn)下降或喪失，在明確菌株利福平抗性遺傳穩(wěn)定性后，再次采用平板對峙法對各抗性菌株的抑菌活性進行檢測，測定方法及抑菌率計算方法同1.4，以明確利福平抗性菌株的抗菌穩(wěn)定性。各處理及試驗均重復(fù)3次。

1.5.4 內(nèi)生細菌番茄定殖特性測定 選取當(dāng)?shù)卦耘喾哑贩N新星101為植物材料，于26 ℃恒溫催芽，待其露白后，播種于裝有2 kg滅菌土壤的塑料花盆中，每盆播種10粒。五葉期間苗，每盆留取長勢一致的幼苗3株，七葉期采用灌根法(每盆接種Rif抗性菌株發(fā)酵液100 mL)和噴霧法(以表面不形成液滴滴落為宜，接種濃度1.6×107cfu/mL)同時接種各內(nèi)生細菌。每隔5 d接種1次，連續(xù)接種3次。于最后一次接種15 d后分別取番茄根際土壤、根系和葉片組織，并于含有Rif質(zhì)量濃度為300 μg/mL的Rif抗性平板中對各菌株的定殖情況進行分析，以接種空白發(fā)酵液為對照，每處理和試驗均重復(fù)3次。

1.6 內(nèi)生細菌對番茄灰霉病害田間防效測定

田間應(yīng)用作為生防微生物研究的最終目的，且田間因素對菌株病害防治效果具有重要影響，因此，在明確內(nèi)生拮抗細菌在番茄中的定殖特性后，還需通過田間試驗對其田間防效進行初步測定，以確保篩選到的目標(biāo)菌株在田間也具有良好防治效果。試驗設(shè)計：(1)制備發(fā)酵液。于超凈工作臺中使用接種環(huán)挑取1環(huán)活化后的內(nèi)生細菌，接種至裝有300 mL BPY發(fā)酵液的500 mL三角瓶中，于28℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h后終止發(fā)酵，獲得內(nèi)生細菌發(fā)酵液，用于后續(xù)田間試驗。(2)番茄灰霉病害田間防效測定。于山西省晉中市太谷縣陽邑鄉(xiāng)番茄種植區(qū)，尋找3處番茄灰霉病害發(fā)病初期大棚進行田間防效測定，在噴灑前對其病情指數(shù)進行調(diào)查,隨后對內(nèi)生細菌發(fā)酵液稀釋50 倍，并使用手持噴壺進行噴霧處理，以空白發(fā)酵液為對照，每處理噴灑番茄2行(36株)。在內(nèi)生細菌50倍發(fā)酵液稀釋液處理7 d后，再次調(diào)查發(fā)病指數(shù)，計算防效，從而確定內(nèi)生細菌的田間防效。番茄葉片和果實灰霉病分級標(biāo)準(zhǔn)以及病情指數(shù)和防效計算參照李瑞環(huán)等[21]的方法進行。

1.7 篩選出的高效內(nèi)生細菌的抗真菌譜測定

以12種植物病原真菌為篩選靶標(biāo)，參照ZHANG等[22]的平板對峙法對篩選出的高效內(nèi)生細菌的抗真菌譜進行測定，抑菌帶越大說明抑菌效果越好。

1.8 篩選出的高效內(nèi)生細菌的分類地位研究

1.8.1 形態(tài)學(xué)鑒定 采用稀釋涂布法，使內(nèi)生細菌于NA平板上形成單菌落，對其菌落形態(tài)進行觀察和記錄，從而明確內(nèi)生細菌在NA平板上的菌落形態(tài)特征。

1.8.2 生理生化鑒定 參照參考文獻[23-24]對內(nèi)生細菌的生理化特性進行測定和鑒定。

1.8.3 16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因鑒定 參照CHEN等[25]和HASAN等[26]的細菌DNA提取方法，對內(nèi)生細菌的基因組DNA進行提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測，檢測合格后用于16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因擴增。

以細菌通用引物27F和1492R[27]、gyrA特異引物gyrAF/gyrAR[28]以及gyrB特異引物BS-F/R[29]為擴增引物，以基因組DNA為模板，分別對內(nèi)生細菌的16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因序列進行擴增。反應(yīng)體系：primermix 12.5 μL、正引物0.5 μL、反引物0.5 μL、DNA 0.5 μL和ddH2O 11 μL；擴增程序：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s、適宜退火溫度下40 s、72 ℃ 延伸90 s(16S rRNA)/45 s(gyrA、gyrB)，變性、退火和延伸循環(huán)30次后，于72 ℃繼續(xù)延伸10 min，最后10 ℃保存，用于電泳檢測和測序。擴增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送交北京六合華大基因公司進行常規(guī)測序。

獲得測序序列后，使用Ezbiocloud website對內(nèi)生細菌的16S rRNA序列同模式菌株進行比對分析；使用NCBI在線BLAST對內(nèi)生細菌gyrA和gyrB序列進行比對分析，并選取適宜近緣種相關(guān)序列，采用Mega 5.0 構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，從分子生物學(xué)角度對內(nèi)生細菌的分類地位進行研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌篩選結(jié)果

以番茄灰霉病菌為靶標(biāo)，采用平板對峙法對58株不同來源內(nèi)生細菌抑菌活性進行測定后發(fā)現(xiàn)，各菌株對B.cinerea抑菌效果差異顯著，其中28株內(nèi)生細菌對該病原表現(xiàn)出一定抑菌效果，其余菌株則無抑菌活性。28株內(nèi)生細菌中，以來源于梓樹葉片中的內(nèi)生細菌ZSY-1對該病原抑菌活性較高，抑菌率為96.17%(表2)。說明菌株ZSY-1在抑制番茄灰霉病菌方面具有明顯優(yōu)勢。

2.2 拮抗細菌在番茄中的定殖特性

對28株對于番茄灰霉病菌具有抑菌活性的菌株在番茄葉片、根系和根際土壤中的定殖能力進行測定后發(fā)現(xiàn)，28株內(nèi)生細菌表現(xiàn)出5種現(xiàn)象：在根際土壤、根系和葉片組織中均穩(wěn)定定殖；僅在根際土壤中定殖；在根際土壤、根系和葉片組織中均無法定殖；可在根際土壤和根系中定殖，而無法在葉片中定殖；在根際土壤中定殖與抑制番茄生長(表3)。其中，菌株FG-6、ZSY-1、FJ-3、ZSJ-4在根際土壤中的定殖效果較好，接種15 d后菌落數(shù)分別為1.76×106、1.67×106、1.65×106、1.35×106cfu/g；菌株FG-6、ZSY-1、FJ-3在番茄根系、葉片中的定殖效果較好，根系中菌落數(shù)分別為1.54×106、1.46×106、1.31×106cfu/g，葉片中菌落數(shù)分別為0.87×106、0.64×106、0.70×106cfu/g。菌株ZSJ-4、HJJ-1、HJG-5雖然可在番茄根際土壤中穩(wěn)定定殖，但均對番茄生長產(chǎn)生明顯抑制，造成幼苗萎焉；菌株ZSG-2、ZSJ-3、ZSY-3、HJJ-3、HJY-4、HJG-1、BJG-1、SZJ-5、SZY-1既無法在番茄根際土壤中定殖，也無法在番茄根系、葉片中定殖或?qū)Ψ焉L產(chǎn)生抑制作用；菌株BJG-3、SZY-3可以在番茄根際土壤中定殖，但在番茄根系、葉片中定殖對番茄生長產(chǎn)生抑制作用。上述結(jié)果表明，菌株FG-6、ZSY-1、FJ-3在番茄灰霉病害防治以及土壤病原殘體清除中具有較好應(yīng)用潛力。

表2 28株內(nèi)生細菌對番茄灰霉病菌的抑菌活性Tab.2 Antifugnal activity of 28 endophytic bacteria against B.cinerea

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。
Note:Different lowercase letters in a column mean significant differences(P<0.05).The same below.

2.3 3株內(nèi)生細菌對番茄灰霉病害的田間防效

在田間對菌株ZSY-1、FG6、FJ-3的番茄灰霉病害防效進行測定后發(fā)現(xiàn)，菌株ZSY-1對番茄灰霉病害具有較好防治效果，對葉片的防治效果可達80.33%，對果實的防治效果可達75.10%(表4)，明顯高于菌株FG-6(田間防效僅約30%)、FJ-3。說明菌株ZSY-1不僅在室內(nèi)具有良好抑菌效果，而且在田間也可保持較好活性，均可保持75%以上的抑菌效果，應(yīng)用潛力良好。

表3 28株內(nèi)生細菌在番茄根系、葉片和根際土壤的定殖特性Tab.3 Colonization characteristic of 28 endophytic bacteria in the root,rhizosphere soil and leaf of tomato

注：—表示該菌株無法在番茄根際土壤、根系或葉片中穩(wěn)定定殖；***表示該菌株對番茄生長產(chǎn)生抑制作用。
Note:— represents the stain didn’t colonize in plant root or rhizosphere or leaf;*** represents the strain inhibited the growth of tomato.

2.4 內(nèi)生細菌ZSY-1的抗真菌譜

采用對峙法對內(nèi)生細菌ZSY-1的抑菌廣譜性進行測定后發(fā)現(xiàn)，該菌株對12種植物病原真菌均具有一定抑菌活性，其中對番茄灰霉病菌、桃褐腐病菌、菜豆菌核病菌、蘋果腐爛病菌、番茄早疫病菌抑菌效果較好，抑菌帶直徑均大于20 mm，分別為26.73、25.17、23.27、22.50、22.47 mm(表5，圖1)；其次為西瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌，抑菌帶直徑分別為18.23、17.97 mm；其他病原真菌中除對棉花立枯病菌抑菌帶直徑達10 mm以上外，其余均小于10 mm。說明菌株ZSY-1具有較廣抑菌譜，在植物病害防治中應(yīng)用潛力明顯。

表4 3株內(nèi)生細菌對番茄灰霉病的田間防效Tab.4 Field effect of three endophytic bacteria against B.cinerea

表5 內(nèi)生細菌ZSY-1對12種植物病原真菌的抑菌活性Tab.5 Antifungal activity of endophytic bacterium ZSY-1 against 12 plant pathogenic fungi

A—L：桃褐腐病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、蘋果腐爛病菌、菜豆菌核病菌、菜豆炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、棉花立枯病菌、小麥赤霉病菌、辣椒枯萎病菌、番茄枯萎病菌、胡蘿卜腐爛病菌A—L:M.Fructicola,B.cinerea,A.solani,V.mali,S.sclerotiorum,C.lindemuthianum,F.oxysporum f.sp.niveum,R.solani,F.graminerum,F.oxysporum f.sp.capsicum,F.oxysporum f.sp.lycopersici and C.fimbriata,respectively圖1 內(nèi)生細菌ZSY-1對12種植物病原真菌的抑菌效果Fig.1 Antifungal effect of endophytic bacterium ZSY-1 against 12 plant pathogenic fungi

2.5 內(nèi)生細菌ZSY-1的分類地位

2.5.1 形態(tài)特征 采用NA固體培養(yǎng)基對菌株ZSY-1形態(tài)特征進行觀察后發(fā)現(xiàn)，該菌株顏色為米白色，表面干燥、褶皺，挑取時表面有較薄皮層，但內(nèi)部濕潤，且邊緣鋸齒狀不整齊(圖2)。

2.5.2 生理生化特性 生理生化試驗結(jié)果表明，菌株ZSY-1可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖、果糖，能水解淀粉，可利用葡萄糖產(chǎn)酸，接觸酶反應(yīng)呈陽性，VP反應(yīng)呈陽性，為兼性厭氧菌，生長溫度為15～50 ℃，且具有一定耐鹽特性，可在2%～8%的鹽濃度下正常生長(表6)。參照參考文獻[23-24]，發(fā)現(xiàn)菌株ZSY-1同枯草芽孢桿菌群菌株生理生化特性基本相似。

圖2 內(nèi)生細菌ZSY-1的NA平板形態(tài)Fig.2 The morphological characteristics of endophytic bacterium ZSY-1 on NA medium

表6 內(nèi)生細菌ZSY-1的生理生化特性Tab.6 Physiological and biochemical characters of endophytic bacterium ZSY-1

注：+表示呈陽性反應(yīng)；—表示呈陰性反應(yīng)。
Note:+ means positive reaction;— means negative reaction.

2.5.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株ZSY-1的16S rRNA、gyrA基因和gyrB基因序列經(jīng)PCR擴增，電泳檢測合格，送交華大基因測序后獲得長度分別為1 417、703、718 bp的相關(guān)序列，序列NCBI登錄號分別為KT381096、KT381097、KX855985。

16S rRNA基因序列經(jīng)Ezbiocloud website同模式菌株進行比對分析后發(fā)現(xiàn)，菌株ZSY-1的16S rRNA序列同枯草芽孢桿菌群模式菌株Bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T和BacillusmethylotrophicusKACC 13105T的序列相似性最高，均為99.93%；選取枯草芽孢桿菌群模式菌株和外群BacilluscereusATCC 14579T，采用Mega 5.0進行序列比對，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，菌株ZSY-1同上述2個模式菌株聚在同一支，說明利用16S rRNA序列很難確定菌株ZSY-1的分類地位，但可確定該菌株隸屬枯草芽孢桿菌群(圖3)，同生理生化特性分析結(jié)果相似。

內(nèi)生細菌ZSY-1gyrA序列經(jīng)NCBI在線BLAST比對分析后發(fā)現(xiàn)，其序列分別同模式菌株B.amyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T、B.methyl-otrophicusKACC 13105T、B.velezensisNRRL B-41580T的相似性最高，均為98%；基于枯草芽孢桿菌群模式菌株和外群BacilluscereusATCC 14579TgyrA序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細菌ZSY-1同樣與模式菌株B.amyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T、B.methylotrophicusKACC 13105T聚在同一支，聚類結(jié)果同16S rRNA序列結(jié)果相同(圖4)，說明內(nèi)生細菌ZSY-1同上述模式菌株具有較高的同源性，且還需其他特異基因輔助來進一步確定內(nèi)生細菌ZSY-1的分類地位。另外，根據(jù)gyrA序列系統(tǒng)發(fā)育樹還可發(fā)現(xiàn)，該特異基因在枯草芽孢桿菌群菌株有效鑒別中的精度較低，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果同16S rRNA序列差異不大。

圖3 內(nèi)生細菌ZSY-1 及其近緣種基于16S rRNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1 and other related taxa based on 16S rRNA gene sequences

gyrB作為另一段特異基因，在枯草芽孢桿菌群近緣種鑒別中具有明顯優(yōu)勢，目前已對該群內(nèi)多數(shù)菌株實現(xiàn)有效鑒別。內(nèi)生細菌ZSY-1gyrB基因序列經(jīng)NCBI在線BLAST比對分析后發(fā)現(xiàn)，該菌株gyrB序列同模式菌株B.amyloliquefacienssubsp.plantarumFZB42T、B.methylotrophicusKACC 13105T、B.velezensisNRRL B-41580T的序列相似性較高，分別為100%、99%、99%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，該菌株同模式菌株B.velezensisNRRL B-41580T聚在同一支，因此，將該菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)(圖5)。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細菌作為生物農(nóng)藥的開發(fā)源之一，分布廣泛、存在于絕大多數(shù)植物中，在植物細菌病害、真菌病害、線蟲病害生物防治中具有重要意義[30]。目前，從多種宿主植物體內(nèi)分離、篩選到的對植物病、蟲害具有良好活性的內(nèi)生細菌多數(shù)是以室內(nèi)平板篩選為主，雖然部分拮抗細菌在室內(nèi)抑菌效果良好，但在田間相對惡劣環(huán)境下可能會喪失活性或活性下降。因此，本研究在利用平板對峙篩選出室內(nèi)抑菌效果良好的拮抗菌株后，還以盆栽試驗和大田試驗分別對菌株的定殖特性和田間防效進行了測定，以期篩選出既可在番茄中定殖，又能在田間保持良好抑菌活性的優(yōu)良生防菌株，為其后期開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

采用平板對峙法，以番茄灰霉病菌為靶標(biāo)對從番茄、梓樹、酸棗、花椒和抱莖苦荬菜中分離到的58株內(nèi)生細菌的平板抑菌活性進行測定后發(fā)現(xiàn)，梓樹內(nèi)生細菌ZSY-1抑菌活性最好，抑菌率為96.17%，其抑菌活性同已報道的地膚內(nèi)生細菌D-29[17]、番茄內(nèi)生放線菌FQ-017[31]、高寒草地禾草內(nèi)生細菌B-401[32]相比具有更好抑菌活性，說明菌株ZSY-1在番茄灰霉病害防治中具有良好應(yīng)用潛力。

圖4 內(nèi)生細菌ZSY-1及其近緣種基于gyrA基因序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1 and other related taxa based on gyrA gene sequences

圖5 內(nèi)生細菌ZSY-1及其近緣種基于gyrB序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 NJ tree showing the phylogenetic positions of endophytic bacterium ZSY-1 and other related taxa based on gyrB gene sequences

在明確菌株ZSY-1的平板抑菌活性后，為進一步明確其在田間條件下的活性，采用利福平抗性標(biāo)記、灌根和噴霧接種方式對其在番茄中的定殖特性和田間灰霉病害防效進行了測定。結(jié)果表明，內(nèi)生細菌ZSY-1不僅可在番茄根際良好存活，而且可在根部和葉片組織良好定殖，處理15 d后，根際土壤、根系、葉片中的數(shù)量分別可達1.67×106、1.46×106、0.64×106cfu/g；田間番茄灰霉病害防效良好，葉部防效可達80.33%、果實防效可達75.10%。其定殖特性明顯好于內(nèi)生細菌01-144[33]、紅樹植物內(nèi)生海洋細菌CⅢ-1[34]和番茄內(nèi)生短短芽孢桿菌QGJ-6[35]；番茄灰霉病田間防效同拮抗菌TB-12[36]、生防菌株YB-81[37]、番茄內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌LNWFD-05[38]、解淀粉芽孢桿菌Ba168[39]、植物乳桿菌IMAU10014[40]相比效果更好，但同海洋芽孢桿菌B-9987[41]、生防菌株SW11[42]、番茄灰霉病拮抗細菌18BS-12[43]等菌株相比防效相似。造成這些差異的原因可能與菌株自身差異、試驗條件、番茄品種、處理方式和時間不同有關(guān)，但依據(jù)上述結(jié)果仍可發(fā)現(xiàn)，非番茄植株土著內(nèi)生細菌也可在番茄體內(nèi)有效定殖，而且不同來源菌株和不同種菌株，在植物病害防治和定殖特性上存在一定差異，在后期植物內(nèi)生抗病細菌研究中，除進行平板活性測定外，還需進一步加強其定殖特性和田間防效研究。

在確定菌株ZSY-1的田間應(yīng)用潛力后，還對其抗菌譜進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株ZSY-1不僅對番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌具有較好抑菌效果，而且還對桃褐腐病菌、蘋果腐爛病菌和菜豆菌核病菌具有良好抑菌效果，抑菌帶直徑均在20 mm以上，其抑菌帶直徑明顯高于中藥白鮮皮內(nèi)生枯草芽孢桿菌TS-5[44]和生防菌株YB-81[37]；且與枯草芽孢桿菌CQ[45]、番茄灰霉生防菌B21[46]和酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌SZG-23[47]存在一定異同，說明不同菌株或不同來源菌株在抑菌特性上也存在一定差異。

細菌鑒定作為細菌資源信息統(tǒng)計整理和發(fā)現(xiàn)新種的必要措施，對查找和認識相關(guān)菌株具有一定意義，因此，在明確菌株ZSY-1的抑菌特性后，采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性、16S rRNA和特異基因gyrA和gyrB相結(jié)合的方法對菌株ZSY-1的分類地位進行了研究，將菌株ZSY-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。在分類地位研究中發(fā)現(xiàn)，特異基因gyrB在枯草芽孢桿菌群菌株分類地位研究中應(yīng)用優(yōu)勢明顯[48]，使用該基因可有效實現(xiàn)該類群菌株的鑒定，而gyrA基因分辨率則相對較低，且在近緣種鑒定中采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生理生化特性和16S rRNA鑒定很難實現(xiàn)有效鑒定，因此，在后續(xù)枯草芽孢桿菌群菌株分類地位研究中可以引入gyrB特異基因，且對活性較好的菌株可以進行基因組測序，從而更加準(zhǔn)確地確定其分類地位[49]。

雖然對貝萊斯芽孢桿菌菌株ZSY-1的抑菌特性、定殖特性、田間防效和分類地位進行了初步測定，但有關(guān)菌株ZSY-1對其他病原菌的田間抑菌活性、抗菌機制、在番茄發(fā)育過程中不同時間點的定殖規(guī)律以及大田定殖規(guī)律還需進一步進行研究，以期明確菌株ZSY-1的田間應(yīng)用價值，并為微生物農(nóng)藥和菌肥開發(fā)提供新菌株。