薇甘菊葉斑病病原菌鑒定及寄主范圍測定

林明輝, 曾偉, 柯沛強

茂名市林業(yè)科學研究所，廣東 茂名 525000

薇甘菊（Mikania micrantha）為菊科藤本植物，通過攀緣并形成厚毯狀枝葉層覆蓋宿主植物，使宿主植物不能進行正常光合作用而衰亡。在2002 年被列入中國首批外來入侵物種名錄，目前主要通過人工鏟除和化學除草劑處理，成本高，效率低下，控制時間短，除草劑對宿主植物造成傷害且污染環(huán)境，控制效果差。

據(jù)國外報道，薇甘菊柄銹菌具有生防潛力[1]，國內(nèi)有關(guān)引進柄銹菌利用文獻報道不少，也取得了較好的效果，但未推廣應(yīng)用，且外來物種的入侵風險仍難以消除[2-4]，程偉文報道了豆莢大莖點霉對薇甘菊的生防潛力，但仍處于試驗階段[5]。

在薇甘菊為害區(qū)域調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其葉片上有一種葉斑病，侵染葉片造成葉斑及葉枯，偶發(fā)侵染莖干造成枝枯，發(fā)生嚴重時，薇甘菊生長明顯衰退，具備作為以菌防草研究的可能。本研究通過對薇甘菊葉斑病病原菌進行分離培養(yǎng)、純化、致病性測定、病原鑒定、生物學特性和寄主范圍測定的研究，旨在明確病原菌，探究病原菌培養(yǎng)特性及對本地主栽農(nóng)作物、水果、經(jīng)濟作物安全性，從而為該菌的利用提供初步參考。

1 材料與方法

1.1 材料

薇甘菊病葉采自化州市良光鎮(zhèn)長安村，薇甘菊覆蓋桉樹及橡膠林地邊緣圍園灌木，部分攀爬桉樹及橡膠樹，微甘菊新葉葉斑病發(fā)生率35%～65%，按常規(guī)方法對病害癥狀進行描述，并拍照。多點采集具備典型癥狀的葉片，保濕帶回實驗室，采樣時間為2018 年4 月至5 月，晴天下午采樣，共采樣3次，每次采集葉片10 片。

1.2 菌株的分離及純化

采用常規(guī)病原體分離法進行分離[6]，共分離50 皿150 個葉片組織塊。對所分離出的真菌菌落采用瓊脂平板稀釋純化法進行純化[7]，并將純化菌株轉(zhuǎn)入試管斜面，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。

1.3 致病性測定

將1.2 純化的菌株共7 株接到PDA 培養(yǎng)基上，置于自然光照培養(yǎng)室25 ℃±1 ℃培養(yǎng)2 d，在無病薇甘菊葉片中央采用無傷離體接種菌絲塊，每片葉接種1 個直接0.4 cm 菌餅，并以接種無菌PDA 培養(yǎng)基為對照，參試菌株7 個，每個處理重復3 次，每個重復接種5 片葉片，保濕并室溫培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。若接種葉片發(fā)病則再分離，完成柯赫法則驗證。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定

將病原菌（1.3 回接發(fā)病的菌株共1 個）接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于自然光照培養(yǎng)室25 ℃±1 ℃培養(yǎng)3 d，觀察病原菌菌落形態(tài)、產(chǎn)孢情況、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)并測量拍照。

1.4.2 病原菌分子生物學鑒定

病原菌分子鑒定方法參照鄭樊[8]。

1.5 溫度對病原菌菌絲生長的影響

根據(jù)華南地區(qū)氣溫及病害發(fā)病規(guī)律，設(shè)置15、21、24、27、30、33、36 及42 ℃等8 個溫度值進行菌絲生長試驗。使用直徑0.4 cm 菌餅接種，培養(yǎng)5 d 后用十字交叉法測定菌落直徑，比較溫度對病原菌菌絲生長的影響。

1.6 病原菌寄主范圍測定

寄主范圍測定以本地主栽農(nóng)作物、水果和經(jīng)濟作物作為參試物，包括水稻、木薯、香蕉、龍眼、芒果、桉樹、橡膠、甘蔗和桑樹等。以菌絲段懸浮液噴霧無傷活體接種，將直徑10 cm 培養(yǎng)皿長滿菌絲的培養(yǎng)基取出，加水200 mL，使用料理機打碎，過濾，加水定容為500 mL，即得接種用菌絲段懸浮液，傍晚噴霧，每個參試作物接種3 次，每次噴霧5 個接種點，完全噴濕接種部位葉片表面，噴霧后5 d，觀察記錄發(fā)病情況，包括病斑形狀、大小、顏色、深度和病征，如出現(xiàn)侵染，在接種后15 d，觀察是否出現(xiàn)未噴霧葉片感染，即是否出現(xiàn)再侵染。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀描述

薇甘菊葉斑病能入侵薇甘菊，使葉片、葉柄及未老化莖產(chǎn)生病變，初期為黃褐色點狀病斑（見圖1A），后逐漸擴大，近圓形或沿葉脈、側(cè)脈擴展成不規(guī)則形病斑，病斑中央植物組織易失去水分而干枯、變薄、易裂、穿孔（見圖1B 和C）。葉柄及枝條的病斑初期為褐色小點、略凹陷，后期不斷擴大呈長條形褐色病斑，直至環(huán)繞枝條一圈。病葉保濕情況下，肉眼或用放大鏡觀察未見小黑點等其他病癥。

2.2 病原菌致病性測定

分離純化菌株回接只有1 個致病，其余菌株和對照不發(fā)病。接種后第3 天癥狀開始出現(xiàn)（見圖2A），發(fā)病初期接種點呈黑色壞死，病健交界明顯，隨后病斑繼續(xù)擴展，初期發(fā)病部位組織壞死分解（見圖2B），將該菌菌落活體接種至薇甘菊無菌苗，表現(xiàn)為葉片及莖段發(fā)病，與田間觀察到的癥狀相似（見圖2C）。

2.3 病原菌形態(tài)

培養(yǎng)性狀及形態(tài)在PDA 上菌落圓形，邊緣未老熟菌絲白色，老熟后菌絲呈黃色，菌落整體顏色初期白色后變黃褐色至深褐色（見圖3A）。在PDA上不產(chǎn)孢，將菌絲接種于薇甘菊無菌苗可產(chǎn)生分生孢子器和分生孢子。

圖1 薇甘菊葉斑病癥狀Fig.1 Symptoms of Mikania micrantha leaf spot

圖2 病原菌致病性測定Fig.2 Pathogenicity test of pathogenic bacteria

分生孢子器黑色、扁球形至球形（見圖3 C 和D），直徑60.2～185.3 μm×72.8～159.2 μm，分生孢子橢圓形到卵圓形，無色，單胞，頂端鈍圓（見圖3 B），分生孢子大?。?.9～7.1 μm×1.3～3.2 μm。

2.4 薇甘菊葉斑病病原系統(tǒng)發(fā)育分析

通過ⅠTS 對引物對菌株進行PCR 擴增、測序，得到長度分別為516 bp 的序列。將得到的序列在GenBank 中進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)MEGA7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，系統(tǒng)發(fā)育樹的各個分支的支持強度通過1 000 次重復的自展檢驗數(shù)值進行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株（WGJ）與Boeremia exigua聚為一個進化枝（見圖4），支持率為100%。依據(jù)形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，葉斑病病原菌經(jīng)鑒定為Boeremia exigua。

2.5 溫度對菌絲生長的影響

試驗結(jié)果看出，15～27 ℃范圍內(nèi)，該病原菌菌落直徑隨溫度升高逐漸增大；27～42 ℃范圍內(nèi)，菌落直徑隨溫度升高逐漸減小。菌絲生長適宜溫度為24～33 ℃，最適溫度27 ℃，42 ℃時菌絲不能生長，菌落直徑與接入菌餅直徑相同（見圖5）。

2.6 病原菌寄主范圍測定

經(jīng)菌絲段懸浮液噴霧接種，除桑樹出現(xiàn)少量病斑，其余參試作物均未出現(xiàn)被侵染癥狀（見表1）。

由表1 可知，所有參試作物，均未出現(xiàn)致死，僅桑樹輕度發(fā)病，并未發(fā)現(xiàn)再侵染。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過對葉斑病的診斷和病原菌形態(tài)觀察測定，包括分生孢子器形態(tài)，分生孢子形狀、分生孢子大小，根據(jù)鑒定結(jié)果查閱相關(guān)資料[9]，初步鑒定薇甘菊葉斑病病原菌為Boeremia屬真菌，依據(jù)形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，葉斑病病原菌經(jīng)鑒定為大豆莖點霉Boeremia exigua。病原菌菌絲生長適宜溫度為24～33 ℃，最適溫度27 ℃，與野外觀測發(fā)生季節(jié)一致。

病原菌寄主范圍測定顯示可侵染桑樹，韋海玲報道Boeremia exigua可致桑斷枝爛葉病[10]，本研究接種未發(fā)現(xiàn)再侵染，具體原因有待進一步研究。王夢奇報道，Boeremia exigua可導致大豆莖點霉葉斑病[11]，但大豆非本地主要作物，未開展試驗。本研究過程中在使用菌絲懸浮液噴灑薇甘菊過程中，薇甘菊宿主團花樹（Neolamarckia cadamba(Roxb.)Bosser）出現(xiàn)葉斑癥狀，亦無再侵染現(xiàn)象發(fā)生。

圖4 基于ⅠTS 序列構(gòu)建ML 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Construction of ML phylogenetic tree based on ⅠTS sequences

圖5 溫度對菌絲生長的影響Fig.5 Effect of temperature on mycelia growth

谷祖敏報道草莖點霉(Phoma herbarum)具備作為生物除草劑防除鴨跖草的潛力，且生物安全性良好和環(huán)境安全性良好[12]。Marcinkowska J 認為，Boeremia exigua為多主寄生真菌，無寄主?；F(xiàn)象[13]。本研究對本地主要農(nóng)作物等開展的寄主范圍測定結(jié)果顯示，大豆莖點霉寄主選擇性較好，具備進一步開展生物除草劑研究的潛力。

表1 病原菌接種不同作物發(fā)病情況Tab.1 Host range determination of pathogenic bacteria