外周血JNK通路磷酸酶、Th1和Th17細胞比率檢測在膿毒癥中的臨床應用

秦超，馮永海，張嬈嬈，卜克，王璐

(鄭州大學第五附屬醫(yī)院 a.重癥醫(yī)學科；b.呼吸與危重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 410052)

膿毒癥(sepsis)是一種由感染誘導異常宿主反應導致的致死性系統(tǒng)疾病，全球每年有上百萬膿毒癥患者[1]。膿毒癥往往發(fā)病迅速，并且常并發(fā)多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，病死率較高[2]。早期識別膿毒癥風險及預后轉歸可在一定程度上增強膿毒癥患者管理水平和降低死亡風險，因此積極探尋可能的生物標志物十分必要[3-5]。JNK通路磷酸酶[Jun N-terminal kinase (JNK) pathway-associated phosphatase，JKAP]既往被發(fā)現(xiàn)可以通過調(diào)控Th1、Th17細胞分化及炎癥因子的釋放，從而參與多種炎癥性或感染性疾病的發(fā)病和進展[6-7]。此外，JKAP還被報道在膿毒癥患者中異常表達[8]。然而，在膿毒癥患者中JKAP與Th1及Th17細胞的關聯(lián)，以及它們作為膿毒癥患病風險和預后標志物的潛能，尚不清楚。因此，本研究旨在探討膿毒癥患者中外周血JKAP水平與Th1、Th17細胞的關聯(lián)，以及它們與膿毒癥發(fā)病和死亡風險的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象本研究連續(xù)納入于2019年1月至2020年12月在鄭州大學第五附屬醫(yī)院就診的79例膿毒癥患者。入組標準：(1)符合2016年國際膿毒癥會議制定的Sepsis 3.0診斷標準[9]；(2)年齡滿18周歲；(3)于癥狀出現(xiàn)后24 h內(nèi)入重癥醫(yī)學科治療。排除標準：(1)合并惡性血液疾病或腫瘤；(2)3個月內(nèi)接受過化療；(3)伴有自身免疫性疾?。?4)長期使用免疫抑制劑或抗生素；(5)孕婦或哺乳期婦女。入組患者的平均年齡為(54.8±12.4)歲；男49例(62.0%)，女30例(38.0%)；平均體質量指數(shù)(body mass index，BMI)為(23.4±3.7) kg·m-2；有吸煙史26例(32.9%)、飲酒史32例(40.5%)、高血壓史33例(41.8%)、高脂血癥史18例(22.8%)、糖尿病史13例(16.5%)、慢性腎病史10例(12.7%)、心腦血管史20例(25.3%)；主要感染部位包括腹部33例(41.8%)、呼吸道15例(19.0%)、皮膚和軟組織14例(17.7%)、血液感染9例(11.4%)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)4例(5.1%)、其他部位4例(5.1%)；血液培養(yǎng)結果為革蘭陰性菌感染43例(54.4%)、革蘭陽性菌感染17例(21.5%)、厭氧菌感染9例(11.4%)、真菌感染3例(3.8%)、支原體感染5例(6.3%)、陰性18例(22.8%)?；颊咧形谎寮◆?serum creatinine，Scr)水平為1.4 mg·dL-1(四分位區(qū)間：0.9～2.01 mg·dL-1，中位白蛋白(albumin，ALB)水平為27.0 g·L-1(四分位區(qū)間：21.6～38.8 g·L-1)，中位白細胞計數(shù)(white blood cell，WBC)水平為16.5×109L-1(四分位區(qū)間：11.2～26.5×109L-1)，中位C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)水平為86.8 mg·L-1(四分位區(qū)間：48.0～131.9 mg·L-1)?；颊呷朐?4 h內(nèi)的急性生理與慢性健康(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHE Ⅱ)評分中位值為13.0(四分位區(qū)間：8.0～17.0)，序貫器官衰竭評估(sequential organ failure assessment，SOFA)評分中位值為5.0(四分位區(qū)間：4.0～8.0)。此外，本研究納入于2020年7月至2020年12月在鄭州大學第五附屬醫(yī)院行體檢的80例健康受試者(年齡和性別與已入組患者匹配)作為對照組。健康受試者平均年齡為(53.7±11.9)歲；男28例(35.0%)，女52例(65.0%)；平均BMI為(22.9±2.9)kg·m-2；有吸煙史21例(26.3%)、飲酒史35例(43.8%)；中位Scr水平為0.8 mg·dL-1(四分位區(qū)間：0.7～1.0 mg·dL-1)，中位ALB水平為42.6 g·L-1(四分位區(qū)間：39.1～47.4 g·L-1)，中位WBC水平為6.4×109L-1(四分位區(qū)間：5.4～7.5×109L-1)，CRP水平為3.6 mg·L-1(四分位區(qū)間：2.4～6.4 mg·L-1)。本研究已獲得醫(yī)院倫理審查委員會批準，且所有患者已提供書面知情同意。

1.2 血液樣本收集和處理所有膿毒癥患者入院后，使用真空采血管采集外周血液樣本。健康受試者的外周血液樣本于體檢時采集。所有血液樣本在采集后，立即通過離心分離獲得血清樣本，通過梯度密度離心分離方法并使用Ficoll?PM 400(Sigma，USA)試劑分離外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。分離后的血清樣本以及PBMC樣本均保存在超低溫冰箱中待后續(xù)檢測使用。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測定 (enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)在血清分離后的24 h內(nèi)，采用人JKAP ELISA 試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國)檢測血清樣本中JKAP的水平；分別采用人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(invitrogen，USA)、人白介素β(interleukin beta，IL-β)ELISA試劑盒(invitrogen，USA)以及人白介素17(interleukin 17，IL-17)ELISA試劑盒(Invitrogen，USA)檢測血清中TNF-α、IL-β以及IL-17的水平，所有ELISA實驗操作過程均嚴格按照試劑盒廠家說明書執(zhí)行。

1.4 流式細胞術分析在PBMC分離后的24 h內(nèi)，采用Human Th1/Th17 Phenotyping Kit (BD PharmingenTM，USA)中的特異性熒光抗體標記CD4陽性T細胞以及Th1、Th17細胞，然后使用流式細胞儀對被標記的細胞進行流式計數(shù)，最終計算出Th1和Th17細胞在CD4陽性T細胞中的比率。具體操作步驟均嚴格按照試劑盒廠家說明書執(zhí)行。

1.5 28 d死亡率評估對所有膿毒癥患者密切觀察隨訪至死亡或直至28 d，記錄28 d內(nèi)的死亡情況，并評估28 d死亡率。

1.6 統(tǒng)計分析變量分布特征采用均值、標準差、中位值、四分位值以及例次百分比進行描述。連續(xù)變量兩組之間的比較分析采用Wilcoxon秩和檢驗。連續(xù)變量間的關聯(lián)采用Spearman秩相關分析。變量對于不同受試者的區(qū)分作用采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線以及曲線下面積(area under the curve，AUC)來評估。使用SPSS 24.0(IBM，USA)軟件進行統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism 7.01軟件(GraphPad Inc.，USA)進行繪圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 JKAP、Th1、Th17在膿毒癥患者中的異常水平與對照組相比較，膿毒癥患者JKAP水平降低[26.5(14.8～43.8)ng·L-1比98.6(53.5～145.5)ng·L-1，P<0.001](圖1 A)，Th1[13.6%(11.9%～18.6%)比9.2%(7.9%～11.0%)，P<0.001]和Th17[3.3%(2.0%～4.9%)比1.8%(1.5%～2.0%)，P<0.001]細胞比率升高(圖1 B～C)。進一步ROC曲線分析表明，JKAP(AUC：0.904，95% CI：0.860～0.949)、Th1細胞(AUC：0.897，95% CI：0.849～0.944)、Th17細胞(AUC：0.804，95% CI：0.728～0.879)水平均可以較好地區(qū)分膿毒癥患者和對照組患者(圖1 D～F)。

圖1 JKAP、Th1和Th17在健康受試者與膿毒癥患者中的差異以及ROC曲線分析

2.2 膿毒癥患者中JKAP與Th1、Th17的關聯(lián)性膿毒癥患者中，JKAP水平與Th1細胞比率(P<0.001)和Th17細胞比率(P<0.001)均呈負相關(表1)。JKAP水平與炎癥因子TNF-α(P=0.008)、IL-1β(P=0.006)和IL-17(P=0.010)呈負相關(表1)。

表1 JKAP與Th1、Th17、TNF-α、IL-1β和IL-17的關聯(lián)性

2.3 膿毒癥患者中JKAP與常見生化指標及疾病綜合評分的關聯(lián)性膿毒癥患者中，JKAP水平與Scr(P<0.001)、WBC(P<0.001)及CRP(P<0.001)水平呈負相關，與ALB呈正相關(P<0.001)(表2)。JKAP水平與疾病綜合評分APACHE Ⅱ(P<0.001)和SOFA(P<0.001)呈負相關(表2)。

2.4 膿毒癥患者中JKAP、Th1、Th17與死亡風險的關聯(lián)性JKAP水平在膿毒癥死亡患者中低于生存患者[20.1(8.2～24.2)ng·L-1比32.8(18.2～49.3)ng·L-1，P<0.001](圖2 A)，Th1[18.2%(14.9%～23.1%)比13.1%(11.6%～17.2%)，P=0.001]和Th17[5.8%(3.2%～9.5%)比2.9%(1.8%～4.0%)，P=0.001]細胞水平在膿毒癥死亡患者中高于生存患者(圖2 B～C)。此外，進一步ROC曲線分析表明，JKAP(AUC：0.799，95% CI：0.697～0.901)、Th1細胞(AUC：0.759，95% CI：0.636～0.882)、Th17細胞(AUC：0.763，95% CI：0.632～0.894)水平均可以預測膿毒癥患者死亡風險(圖2 D～F)。

表2 JKAP與生化指標和疾病嚴重程度的關聯(lián)性

圖2 JKAP、Th1和Th17在膿毒癥生存患者與死亡患者中的比較以及ROC曲線分析

3 討論

本研究通過檢測膿毒癥患者外周血中JKAP、Th1和Th17細胞水平，發(fā)現(xiàn)他們不僅在膿毒癥患者中異常表達，并且有作為膿毒癥患者死亡風險標志物的潛能。此外，膿毒癥患者中JKAP水平與Th1和Th17細胞水平高度相關，并且還與患者系統(tǒng)性炎癥水平和疾病嚴重程度相關，進一步表明JKAP作為膿毒癥生物標志物的潛能及可能機制。

JKAP在調(diào)控多種免疫和炎癥性反應中均有著重要作用。一項既往研究報道，JKAP可以通過調(diào)控CD4+T細胞分化及炎癥因子參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病和進展[7]。另外一項研究報道，JKAP可以通過激活CD4+T細胞并促進其向Th1和Th17分化，并同時調(diào)控炎癥因子，從而參與炎癥性腸病的疾病進展[6]。此外，JKAP還被報道與克羅恩病低的患病風險、炎癥水平和疾病活動度相關[10]，并且其與哮喘患兒低的炎癥水平和急性發(fā)作風險亦相關[11]；再者，JKAP還被發(fā)現(xiàn)有作為類風濕性關節(jié)炎和幼年特發(fā)性關節(jié)炎患病風險、炎癥和疾病活動度標志物潛能[12-13]。至于JKAP在感染性疾病中的應用，僅有一篇研究報告JKAP在膿毒癥患者中異常表達[8]。以上研究均表明，JKAP有作為炎癥性/感染性疾病生物標志物的潛能。本研究進一步發(fā)現(xiàn)了JKAP在膿毒癥患者中低表達，并且可以較好地對膿毒癥患病風險起到預測作用，這與既往報道結果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)JKAP水平與膿毒癥患者炎癥水平和疾病嚴重程度呈負相關。可能的解釋原因有：(1)JKAP通過調(diào)控Lck通路和MAPK通路從而阻斷T細胞信號傳導通路，調(diào)節(jié)多個下游炎癥因子，從而抑制膿毒癥患者炎癥水平并制止疾病的惡化[14-15]；(2)JKAP抑制CD4+T細胞的激活，并阻礙Th1和Th17細胞分化及對應炎癥因子的釋放，從而降低膿毒癥患者炎癥水平和疾病嚴重程度[6-7]；(3)JKAP與膿毒癥患者少/輕的器官損傷相關(與肝腎功能指標等關聯(lián)體現(xiàn))，從而間接影響膿毒癥患者疾病的嚴重程度。

關于Th1和Th17細胞在膿毒癥中的調(diào)控作用，已經(jīng)有較多研究報道。例如，研究發(fā)現(xiàn)Th1細胞和Th17細胞在感染性疾病尤其是膿毒癥患者中呈現(xiàn)高水平[16-17]。本研究也發(fā)現(xiàn)Th1和Th17在膿毒癥患者中表現(xiàn)出高水平，這與既往研究一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者中JKAP水平不僅與Th1細胞水平相關，還與Th17細胞水平相關，暗示膿毒癥患者中JKAP也參與了Th1和Th17的調(diào)控?？赡芙忉屧驗镴KAP可能通過調(diào)節(jié)Lck通路和MAPK通路，抑制T細胞信號傳導，弱化CD4+T細胞激活及Th1、Th17細胞分化[6-7,14-15]。

關于JKAP、Th1和Th17水平在膿毒癥中的預后作用，目前少有研究報道。本研究進一步分析發(fā)現(xiàn)，JKAP在膿毒癥死亡患者中低表達，而Th1和Th17細胞在膿毒癥死亡患者中呈現(xiàn)高水平，并且三者均可以在一定程度上預測膿毒癥患者的死亡風險，這進一步表明JKAP作為膿毒癥預后生物標志物的潛能及可能機制?？赡茉蛴校?1)JKAP通過抑制Th1和Th17分化，降低膿毒癥患者系統(tǒng)性炎癥及疾病嚴重程度，從而降低膿毒癥患者死亡風險[6-7,14-15]；(2)JKAP還可以通過降低膿毒癥多器官損傷(與肝腎功能指標等關聯(lián)體現(xiàn))，從而降低其死亡風險。

本研究存在一些不足：(1)本研究樣本量較低，可能導致低的統(tǒng)計效能，因此將來需進一步執(zhí)行大樣本研究以驗證本研究結果；(2)本研究患者主要來自單個地區(qū)，因此可能存在患者選擇偏倚，因此將來進一步跨地域多中心研究是必要的；(3)本研究評估了患者的28 d死亡率，而JKAP、Th1和Th17在膿毒癥患者長期預后中的作用，需要進一步探索。

綜上所述，JKAP與Th1、Th17細胞高度相關，并且有作為膿毒癥患病風險、疾病嚴重程度監(jiān)控及短期預后生物標志物的潛能。