miR-2861在食管鱗癌患者血清中的表達(dá)及臨床意義

史露賓，李世寶，彭晴，毛逸琪，馬萍(.徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州000；.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇徐州000)

中國(guó)作為食管癌高發(fā)地區(qū)之一，發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平[1]。根據(jù)其組織來(lái)源不同，可將其分為食管鱗癌(ESCC)和食管腺癌(EAC)，在我國(guó)ESCC患者占比超過(guò)90%，且預(yù)后較差，5年生存率不足20%[2]。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)作為目前臨床上常用的食管癌的診斷和預(yù)后標(biāo)志物，其敏感性和特異性均較低。因此，急需一種敏感性較高且容易獲得的新型標(biāo)志物以提高ESCC早期檢出率。研究證實(shí)，miR-2861在多種腫瘤中發(fā)揮著重要的作用，例如乳頭狀甲狀腺癌[3]，宮頸癌[4]，肺癌[5]等。然而，其在食管癌中的報(bào)道少見(jiàn)。本研究檢測(cè)了miR-2861在ESCC患者血清中的表達(dá)水平，分析了其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并且評(píng)估其對(duì)ESCC的診斷效能，以期為ESCC診斷提供新的腫瘤標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2018年9月至2019年6月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科、胸外科就診的食管癌患者49例，男41例，女8例，年齡(66.0±8.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均經(jīng)病理組織活檢證實(shí)為ESCC；(2)入組前未經(jīng)手術(shù)、放療、化療等治療；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他腫瘤者；(2)患有嚴(yán)重心、肺、腎、神經(jīng)系統(tǒng)等疾??；(3)患有嚴(yán)重精神疾病者。臨床分期：按國(guó)際抗癌聯(lián)盟 (UICC)第七版TNM標(biāo)準(zhǔn)分期分為T1/T2期24例，T3/T4期25例；腫瘤大?。骸? cm 22例，<5 cm 27例；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；存在神經(jīng)侵犯21例，無(wú)神經(jīng)侵犯28例；分化程度：高分化18例，中、低分化31例；腫瘤標(biāo)志物(包括CEA、CA19-9、CA125、CA72-4、SCCA)升高：是15例，否34例。收集同期于本院消化內(nèi)科就診的食管良性疾病(主要為食管良性腫瘤、食管炎)患者36例，患者均經(jīng)內(nèi)鏡檢查確診，男31例，女5例，年齡(52.9±12.6)歲；另收集同期在本院體檢健康者48例作為健康人對(duì)照組，男39例，女9例，年齡(66.8±7.8)歲，各組的年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(XYFY2021-JS004-01)，患者均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 TRIzol Universal總RNA提取試劑(北京天根生化科技公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海同科生物科技公司)，PCR試劑盒(廣州銳博生物技術(shù)公司)。Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，NanoDrop 1000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)。

1.3標(biāo)本采集 使用含有分離膠的促凝采血管采集各研究對(duì)象住院時(shí)(體檢健康者于體檢時(shí)采集)的空腹靜脈血5 mL，2 h內(nèi)于4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，置于無(wú)RNase的EP管中，樣本置-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照TRIzol Universal總RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)提取血清總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)及濃度及純度，選取吸光度(A260/280 nm)在1.8～2.0的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，標(biāo)本置于-20 ℃保存。

1.5引物設(shè)計(jì)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GenBank中miR-2861和內(nèi)參U6基因的序列號(hào)(分別為NR_037217和NR_138085)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并送廣州銳博生物技術(shù)公司合成[6]。miR-2861上游引物序列：5′-CCTCTGCAGCTCCGGC-3′，下游引物序列：5′- CTCTTCCGGTCTCCGCCC-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小82 bp。U6上游引物序列：5′-TAGGGAGACAGGGTGCTGAA-3′，下游引物序列：5′-AAAGCCCTTCAGGATACCGC-3′，退火溫度60 ℃，產(chǎn)物片段大小94 bp。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6.4 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 2 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s，共50個(gè)循環(huán)。用PCR儀配套的LightCycler?96分析軟件在70～95 ℃采集熒光信號(hào)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以U6為內(nèi)參照。結(jié)果以Ct值表示，miR-2861的相對(duì)表達(dá)水平以2-△△Ct法計(jì)算。公式：ΔΔCt=[(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)-(健康人對(duì)照組Ct目的基因-健康人對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。

2 結(jié)果

2.1miR-2861在各組血清樣本中的表達(dá)水平 miR-2861在49例ESCC患者(8.34±7.81)、36例食管良性疾病患者(8.89±7.98)及48例體檢健康者(1.71±1.70)血清標(biāo)本中的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.42,P<0.001)，進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較結(jié)果表明，ESCC組血清miR-2861相對(duì)表達(dá)量與良性疾病組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.677,P>0.05)，但食管癌組較健康人對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.310,P<0.01)。

2.2血清miR-2861的表達(dá)與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以ESCC患者血清miR-2861相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)(5.23)為分界，將其分為高表達(dá)組(31例)和低表達(dá)組(18例)，分析兩組與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-2861的表達(dá)水平與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、分化程度、腫瘤標(biāo)志物升高均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，但與分期、大小有關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 血清miR-2861的表達(dá)與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3miR-2861對(duì)ESCC的診斷效能評(píng)估 ROC曲線結(jié)果顯示，血清miR-2861診斷ESCC的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.67(95%CI:0.58～0.76)，當(dāng)cut-off值為1.584時(shí)，其敏感性為87.5%，特異性為49.41%。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-2861對(duì)ESCC診斷的ROC曲線

3 討論

研究表明，miRNA在食管癌組織或細(xì)胞系中的表達(dá)譜與正常組織或細(xì)胞中的表達(dá)譜存在明顯差異，為食管癌診斷提供了重要的參考價(jià)值[7]。不同種類的miRNA在食管癌中的表達(dá)水平可能升高或者下降，有望成為食管癌診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。例如，miR-7在食管癌患者血清標(biāo)本中呈低表達(dá)，并且其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小有關(guān)，表明血清miR-7可能作為食管癌診斷的無(wú)創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物[8]。與之相反的是，Lin等[9]通過(guò)比較101例食管癌患者與97例健康人血漿中miR-34a的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管癌患者血漿miR-34a的表達(dá)上調(diào)，并且在早期食管癌診斷中敏感性及特異性均較高。

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)證實(shí)了miR-2861在ESCC患者血清標(biāo)本的表達(dá)水平明顯升高，其可能作為致癌基因在ESCC中發(fā)揮作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-2861在ESCC組與食管良性疾病患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，分析原因可能與納入的食管良性疾病患者數(shù)量較少有關(guān)。筆者通過(guò)分析miR-2861的表達(dá)與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-2861水平與分化程度和腫瘤大小明顯相關(guān)(P<0.05)。在診斷效能方面，Zheng等[10]通過(guò)ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-155在食管癌診斷中的臨床價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其診斷食管癌的AUCROC為0.870，敏感性和特異性分別為83.5%和77.5%，是食管癌患者總生存期的1個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，并且可作為ESCC潛在的診斷標(biāo)志物。本研究以食管良性疾病+體檢健康者為對(duì)照組，以ESCC為疾病組，采用ROC曲線評(píng)估其診斷ESCC的臨床效能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其敏感性為87.5%，特異性為49.41%，表明miR-2861有望作為ESCC潛在的新型診斷標(biāo)志物。

本研究尚存在一些不足之處，例如由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間有限以及隨訪困難，目前尚未對(duì)食管癌患者進(jìn)行跟蹤采血檢測(cè)miR-2861的變化水平，也并未在細(xì)胞水平檢測(cè)miR-2861的表達(dá)，并分析其生物學(xué)功能。下一步我們將擴(kuò)大樣本量，收集患者隨訪資料分析預(yù)后信息，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-2861潛在的靶基因以及可能參與的信號(hào)通路，同時(shí)進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)深入研究miR-2861在ESCC中的發(fā)病機(jī)制，為個(gè)性化治療提供依據(jù)。