老年性白內(nèi)障與MTHFR基因、同型半胱氨酸及B族維生素的相關(guān)性

羅軍,楊渝偉(綿陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川綿陽 635000)

隨著人口老年化，老年性白內(nèi)障成為全球視力損害乃至致盲的首要原因[1]。大量研究證實(shí)，蛋氨酸代謝對(duì)維持晶狀體透明度十分重要，尤其是代謝過程中亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)及其產(chǎn)物——同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)與老年性白內(nèi)障密切相關(guān)[2]。HCY代謝副產(chǎn)物——同型半胱氨酸硫內(nèi)酯可引起晶狀體蛋白發(fā)生N-同型半胱氨酸化，從而引起結(jié)構(gòu)和溶解度改變，最終導(dǎo)致白內(nèi)障[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)，MTHFRC677T單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可嚴(yán)重影響MTHFR酶活性，進(jìn)而影響HCY和葉酸(folic acid, FOL)的代謝[4]。然而，目前MTHFR基因多態(tài)性與老年性白內(nèi)障的研究報(bào)道少見。因此，本研究納入MTHFR酶的重要代謝物質(zhì)——維生素B12(vitamin B12, VitB12)、VitB6、FOL和HCY，重點(diǎn)評(píng)估MTHFR基因多態(tài)性與老年性白內(nèi)障的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2020年6月綿陽市中心醫(yī)院就診的663例老年性白內(nèi)障患者作為疾病組，其中男312例，女351例，年齡51～88歲，中位年齡69歲。并于同期隨機(jī)選擇646例體檢健康者作為健康人對(duì)照組，其中男308例，女338例，年齡50～93歲，中位年齡67歲。受試者均按照國際指南診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行眼科檢查，包括視力、裂隙燈和眼底檢查。納入標(biāo)準(zhǔn)：漢族；年齡50歲以上；視力<0.7；老年性白內(nèi)障患者晶狀體發(fā)生變性和渾濁，但無其他眼科疾??；健康人對(duì)照無白內(nèi)障癥狀和體征，以及其他眼科疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的肝腎疾病、冠心病、糖尿病、風(fēng)濕性疾病、癌癥及腦血管疾病等，以及服用抗癲癇藥物、免疫抑制劑等導(dǎo)致HCY增高的藥物。兩組間的年齡(t=0.818,P=0.414)及性別(χ2=0.050,P=0.823)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)綿陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批準(zhǔn)文號(hào)：S-2018-085)，各研究對(duì)象均知情同意。

1.2儀器與試劑 QuantStudio實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Cobas 6000全自動(dòng)生化分析儀(德國羅氏公司)，ARCHITECT i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑(美國雅培公司)，EXT 9050MD超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑(濟(jì)南英盛生物公司)，EDTA-K2和SSTTM ⅡAdvance真空采血管(美國BD公司)，MTHFRC677T基因型檢測(cè)試劑盒(西安金磁納米生物公司)，HCY檢測(cè)試劑盒(四川邁克生物公司)。

1.3方法

1.3.1樣本采集 所有受試對(duì)象(體檢健康者于體檢時(shí))均在治療前，于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，分別用EDTA-K2和SSTTM ⅡAdvance真空采血管采集靜脈血2.0 mL和5.0 mL，充分混勻。EDTA-K2管內(nèi)的全血樣本用于MTHFRC677T基因型檢測(cè)，若不能及時(shí)檢測(cè),置于2～8 ℃保存不超過7 d；SSTTM ⅡAdvance真空采血管靜置約30 min，2 000×g離心10 min，分離血清，在4 h內(nèi)完成HCY、FOL、VitB12和VitB6檢測(cè)。

1.3.2MTHFRC677T基因型檢測(cè) 采用地高辛標(biāo)記PCR-抗地高辛標(biāo)記金磁微粒層析法，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：等位基因C和T分別擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過地高辛-抗地高辛結(jié)合，或與金磁微粒結(jié)合，然后在2個(gè)獨(dú)立的層析系統(tǒng)中進(jìn)行層析，根據(jù)檢測(cè)線是否出現(xiàn)條帶，判讀C677T位點(diǎn)的基因型。若僅等位基因C層析系統(tǒng)出現(xiàn)條帶，則為CC基因型；若僅等位基因T層析系統(tǒng)出現(xiàn)條帶，則為TT基因型；若等位基因C和T層析系統(tǒng)均出現(xiàn)條帶，則為CT基因型。

1.3.3血清各指標(biāo)檢測(cè)方法 血清HCY測(cè)定采用同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶/S-腺苷同型半胱氨酸水解酶循環(huán)法，用Cobas 6000全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；血清FOL測(cè)定采用釕標(biāo)葉酸結(jié)合蛋白競(jìng)爭法，用ARCHITECT i2000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)；血清VitB12和VitB6測(cè)定采用質(zhì)譜分析法，用EXT 9050MD超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。所有項(xiàng)目均嚴(yán)格按照操作說明書進(jìn)行。參考范圍：HCY≤15 μmol/L；FOL：3.1～20.5 ng/mL；VitB12：0.1～2.1 ng/mL；VitB6：2～25 ng/mL。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0和MedCalc醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示，組間比較采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣本的比較采用單因素方差分析，采用Jonckheere-Terpstra趨勢(shì)分析各指標(biāo)與不同基因型的相關(guān)性，用多元Logistic回歸分析基因型或老年性白內(nèi)障的風(fēng)險(xiǎn)因素；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1疾病組與健康人對(duì)照組MTHFR單核苷酸多態(tài)性的比較MTHFRC677T位點(diǎn)TT、CT和CC基因型的分布頻率在疾病組中分別為23.08%(153/663)、52.34%(347/663)、24.58%(163/663)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.773，P=0.679)；在健康人對(duì)照組中分別為16.10%(104/646)、46.90%(303/646)、37.00%(239/646)，亦符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=0.122，P=0.941)；但兩組間CC(χ2=10.094,P=0.002)、CT(χ2=3.870,P=0.049)和TT(χ2=23.701,P<0.001)基因型分布頻率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，C667T突變率在疾病組和健康人對(duì)照組中分別為49.25%(653/1 326)和39.55%(511/1 292)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.910,P<0.001)。

2.2疾病組與健康人對(duì)照組血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較 經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)，疾病組HCY水平顯著高于健康人對(duì)照組(P<0.001)，而FOL、VitB12和VitB6顯著低于健康人對(duì)照組(P<0.001)。見表1。然而，在兩組內(nèi)部進(jìn)行不同性別之間的差異分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康人對(duì)照組中上述4項(xiàng)指標(biāo)水平均無性別差異(P均>0.05)，在疾病組中除VitB6(Z=1.134,P=0.257)外，男性患者HCY水平明顯升高(Z=9.882,P<0.001)，而FOL和VitB12水平下降明顯(Z分別為-5.624和-6.968,P均<0.001)。見表2。

表1 兩組血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較[M(P25,P75)]

表2 兩組血清HCY、葉酸、VitB12和VitB6水平的性別差異比較[M(P25,P75)]

2.3不同MTHFR基因型亞組間血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較 分別將所有受試者、健康人對(duì)照組和疾病組，按不同MTHFR基因型分成3個(gè)亞組，采用Jonckheere-Terpstra趨勢(shì)分析HCY、FOL、VitB12和VitB6水平的變化趨勢(shì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著MTHFRC677T突變數(shù)增加(即CC→CT→TT)，無論是所有受試者，還是健康人對(duì)照組或疾病組，HCY水平均逐漸增加(Z分別為11.856、7.653和8.266，P均<0.001)，而FOL(Z分別為-8.443、-5.212和-10.634，P均<0.01)和VitB12(Z分別為-2.935、-2.226和-3.069，P均<0.01)水平均逐漸降低。見表3。

表3 不同MTHFR基因型亞組血清HCY、FOL、VitB12和VitB6水平比較

進(jìn)一步進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)，在所有受試者、健康人對(duì)照組和疾病組中，受試者TT基因型HCY(Z分別為13.322、8.169和8.559，P均<0.001)顯著高于CT基因型，而FOL(Z分別為-6.683、-4.126和8.670，P均<0.001)和VitB12(Z分別為-3.251、-2.490和3.468，P均<0.001)顯著低于CT基因型；但在CT基因型受試者中，HCY(Z分別為7.586、5.044和5.666，P均<0.001)高于CC基因型，F(xiàn)OL(Z分別為-6.302、-3.891和7.694，P均<0.001)低于CC基因型，而VitB12變化不顯著(P均>0.05)。

2.4各觀察指標(biāo)與MTHFR基因突變和疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)分析 經(jīng)多元Logistic回歸分析，對(duì)于MTHFR基因突變和老年性白內(nèi)障，HCY(OR分別為1.18和1.24,P均<0.001)是危險(xiǎn)因素，F(xiàn)OL(OR分別為0.91和0.95,P均<0.001)是保護(hù)因素；而VitB12水平與MTHFR基因突變無關(guān)聯(lián)，卻是老年性白內(nèi)障的保護(hù)因素(OR=0.86,P=0.001)。校正年齡和性別后，結(jié)果與之類似；并且相比CC型，CT型和TT型受試者患老年性白內(nèi)障風(fēng)險(xiǎn)增加(校正前：OR分別為1.68和1.84,P均<0.01；校正后：OR分別為1.62和1.76，P均<0.01)。見表4。

表4 MTHFR基因突變和疾病發(fā)生的多元Logistic回歸分析

3 討論

老年性白內(nèi)障是一種多因素相互作用的疾病。據(jù)哈佛大學(xué)一項(xiàng)對(duì)4 500萬人24年跟蹤調(diào)查報(bào)道表明，年齡是老年性白內(nèi)障的決定性影響因素，而環(huán)境和遺傳因素則是主要的致病誘因[6]。此外，環(huán)境因素，如高強(qiáng)度的紫外線，太亮、太暗、炫光、反光的周圍環(huán)境，以及密閉工作環(huán)境內(nèi)化學(xué)毒物的影響，均可導(dǎo)致年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病時(shí)間提前。近年來研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素與年齡相關(guān)性白內(nèi)障密切相關(guān)，如著色性干皮病基因D、8-氧鳥嘌呤糖基酶-1基因和MTHFR基因多態(tài)性[7-8]。但迄今為止，國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少，且尚存爭議。有學(xué)者認(rèn)為MTHFRC677T多態(tài)性的CC和TT基因型具有保護(hù)作用[8]；但也有學(xué)者認(rèn)為，MTHFRC677T多態(tài)性的CT/TT基因型與皮質(zhì)性白內(nèi)障風(fēng)險(xiǎn)增加獨(dú)立相關(guān)[9]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，老年性白內(nèi)障患者M(jìn)THFRC677T等位基因中，TT型和CT型均明顯高于健康人對(duì)照；此外，相比CC型患者，CT型和TT型患者老年性白內(nèi)障風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。

本研究首先探討了MTHFR基因多態(tài)性與FOL/HCY代謝的關(guān)系。MTHFR所編碼的酶是FOL/HCY代謝中的關(guān)鍵酶[10]，其C677T基因多態(tài)性是指其677位點(diǎn)發(fā)生C(胞嘧啶)→T(胸腺嘧啶)突變。既往研究證實(shí)，此突變可導(dǎo)致其編碼酶的活性和熱穩(wěn)定性下降[11]。受酶活性改變的影響，F(xiàn)OL/HCY代謝過程中相關(guān)物質(zhì)的血清水平也將隨之改變，主要包括VitB12、VitB6、FOL和HCY。本研究結(jié)果證實(shí)，MTHFRC677T基因突變與HCY及FOL水平有關(guān)，而VitB12和VitB6水平所受影響較小。表明MTHFRC677T突變導(dǎo)致了MTHFR所編碼酶活性降低，引起HCY在體內(nèi)積聚，進(jìn)而發(fā)生高同型半胱氨酸血癥；而FOL作為HCY代謝的重要底物，則因高同型半胱氨酸血癥而消耗增加，呈現(xiàn)出FOL水平降低。至于同樣參與了FOL/HCY代謝的VitB12和VitB6，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，二者降低均與MTHFRC677T基因突變無明顯的關(guān)聯(lián)，分析原因可能與其血液中含量較低，從而受到的影響較小，或者經(jīng)食物補(bǔ)充和腸道吸收功能代償?shù)仍蛴嘘P(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)一些不同于既往報(bào)道[12]的FOL/HCY代謝特點(diǎn)，如老年性白內(nèi)障患者血清VitB12和VitB6水平低于健康人對(duì)照，分析原因可能存在地域和飲食習(xí)慣差異；男性患者HCY水平顯著高于女性患者，這可能與男性吸煙、過量飲酒等有關(guān)[13]。

本次試驗(yàn)在探討MTHFR基因多態(tài)性與老年性白內(nèi)障的關(guān)系的同時(shí)，還納入了FOL/HCY代謝過程中的重要代謝物質(zhì)作為影響因素。大量文獻(xiàn)報(bào)道表明，F(xiàn)OL/HCY代謝與白內(nèi)障關(guān)系密切。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，HCY可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力，引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡和晶狀體上皮細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生，導(dǎo)致晶狀體損傷[13]。另有研究證實(shí)，F(xiàn)OL可減輕HCY引起的氧化應(yīng)激作用，減輕晶狀體損傷[14]。本研究經(jīng)多元Logistic回歸分析證實(shí)，F(xiàn)OL/HCY代謝也與老年性白內(nèi)障顯著相關(guān)，其中HCY是引起老年性白內(nèi)障的危險(xiǎn)因素，而FOL和VitB12則是保護(hù)因素，這與國內(nèi)外研究報(bào)道一致[13,15]。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，即使在校正了年齡、性別以及FOL/HCY代謝過程中的重要代謝物質(zhì)的影響后，MTHFR基因多態(tài)性仍然是老年性白內(nèi)障的潛在危險(xiǎn)因素。國外研究報(bào)道，CT/TT基因型白內(nèi)障患者中，僅33%歸因于MTHFR基因多態(tài)性所致HCY升高的間接途徑，而67%則歸因于該基因多態(tài)性的直接遺傳途徑[9]。因此，建議在對(duì)老年人進(jìn)行眼睛保健時(shí)，可納入MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測(cè)，以識(shí)別白內(nèi)障的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

盡管本研究證實(shí)MTHFRC677T基因多態(tài)性可能與老年性白內(nèi)障有關(guān)，但本研究尚存在一定的局限性。例如，在本次試驗(yàn)過程中，所有環(huán)境因素(如紫外線照射、光照及毒物的影響等)難以評(píng)估而均未納入，結(jié)果是否受到環(huán)境因素影響并未評(píng)估；除VitB12和VitB6外，其他營養(yǎng)物質(zhì)(如維生素A、C、D、E和K1等)均已證實(shí)與年齡相關(guān)性白內(nèi)障有關(guān)[12]，但受檢測(cè)限制未納入。因此，有必要進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，MTHFRC677T CT/TT基因型患者發(fā)生老年性白內(nèi)障的風(fēng)險(xiǎn)增加，同時(shí)受MTHFR基因編碼的酶活性降低的影響，HCY、FOL和VitB12水平改變均與老年性白內(nèi)障的進(jìn)展相關(guān)。因此，應(yīng)常規(guī)將MTHFRC677T基因型檢測(cè)納入眼科保健項(xiàng)目，以判斷白內(nèi)障的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)定期檢測(cè)血清中HCY、FOL和VitB12水平，及時(shí)采取補(bǔ)充B族維生素、甜菜堿和N-乙酰半胱氨酸[8]等預(yù)防和治療措施，可能有助于延緩老年性白內(nèi)障的發(fā)生、發(fā)展。