超級增強(qiáng)子長鏈非編碼RNA LINC01232在大腸癌組織中的表達(dá)及其對癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

陳緩緩，鄭鈞予，江盼，嚴(yán)楓(南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院&江蘇省腫瘤醫(yī)院&江蘇省腫瘤防治研究所檢驗(yàn)科，南京210009)

大腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率每年呈不斷上升趨勢[1-2]。早期診斷和有效治療可以在一定程度上提高患者的生存率，因此，盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對大腸癌的診斷和治療有著重要的意義。

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄本大于200 nt，且不具有編碼蛋白質(zhì)能力的RNA[3]。超級增強(qiáng)子長鏈非編碼RNA(SE-LncRNA)是一類由超級增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄或與其相互作用的LncRNA[4-5]。研究表明，SE-LncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[6]。有學(xué)者通過基因芯片在大腸癌組織中篩選差異表達(dá)的SE-LncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC01232呈異常高表達(dá)，且證實(shí)其在胰腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)，并可通過多種不同機(jī)制調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。然而，目前關(guān)于LINC01232在大腸癌中的表達(dá)和作用的研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究旨在探討和分析LINC01232在大腸癌組織中的表達(dá)水平及其對大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本采集 收集2017年10月至2019年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院就診的大腸癌患者經(jīng)外科手術(shù)切除的35對癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距離病灶邊界>2 cm，無癌細(xì)胞)，隨機(jī)抽取4對進(jìn)行基因芯片分析，另外31對進(jìn)行臨床及實(shí)驗(yàn)分析。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)病理組織學(xué)確診為大腸癌，并無其他癌癥病史;(2)無任何放化療、生物免疫劑等治療史;(3)無任何腸炎癥病史；(4)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)非首次確診患者；(2)圍手術(shù)期發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥。其中31例患者中，男16例，女15例，年齡(58±12)歲，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ～Ⅳ期14例。本研究通過南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)[批準(zhǔn)號：南醫(yī)大倫審(2019)843號]，患者及家屬知情同意。

1.2細(xì)胞系、主要試劑及儀器 大腸癌細(xì)胞系HCT-116和HT-29購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。McCoy5A′培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、CCK-8檢測試劑均購自江蘇凱基生物公司，胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司， TRIzol試劑購自美國Life technologies公司，Quick Amp標(biāo)記試劑盒(Agilent p/n 5190-0442)、安捷倫基因表達(dá)雜交試劑盒(Agilent p/n 5188-5242)購自美國Agilent Technologies公司，Hiscript?ⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄試劑和ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑購自南京諾唯贊生物公司，Lipofectamine RNAiMAX購自美國Invitrogen公司，LINC01232 Smarter Silence和陰性對照negative control試劑購自廣州銳博生物公司，TM9SF2兔多克隆抗體(ab121227)和GAPDH兔單克隆抗體(ab9485)購自美國Abcam公司。Transwell小室購自美國Corning公司，SpectraMax i3x多功能酶聯(lián)儀購自美國Molecular Devices公司，QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Applied biosystems公司，NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)(美國NanoDrop公司)。

1.3方法

1.3.1基因芯片生物信息學(xué)分析 基因芯片分析包含4對大腸癌組織及對應(yīng)的癌旁組織。采用TRIzol試劑提取組織總RNA，用NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)檢測總RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.0之間，A260/230 nm值>2.0的RNA樣本，置于-80 ℃保存。使用Quick Amp標(biāo)記試劑盒(Agilent p/n 5190-0442)將RNA轉(zhuǎn)錄成Cy3標(biāo)記的cDNA，按照安捷倫基因表達(dá)雜交試劑盒(Agilent p/n 5188-5242)說明書對cDNA進(jìn)行雜交，通過安捷倫特征提取軟件(v11.0.1.1)獲取陣列圖像，并經(jīng)GeneSpring GX v12.1軟件包(Agilent Technologies)分析和標(biāo)準(zhǔn)化，最后通過P<0.05且Fold Change>2篩選差異表達(dá)的SE-LncRNA，其中超級增強(qiáng)子相關(guān)信息來源dbSUPER數(shù)據(jù)庫。

1.3.2RT-qPCR檢測 將75 mg大腸癌組織及癌旁組織快速研磨成勻漿，每個(gè)樣本加入700 μL TRIzol試劑提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Hiscript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。LINC01232上游引物序列：5′-AAAACCTTGAAATCCCTTAATACCA-3′,下游引物序列：5′-CCTTACCCGTGGAATTCACATATA-3′[7];TM9SF2上游引物序列：5′-CCTCCAAGAAAAGGGATGCTGC-3′,下游引物序列：5′-ACAGGACCACAGCACACGTCAT-3′[8]；GAPDH上游引物序列:5′-ATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′,下游引物序列：5′-GTGCTAAGCAGTTGGTGGTG-3′[9]。按照ChamQ Universal SYBR?qPCR Master Mix說明書進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為10 μL，分別為上、下游引物各0.5 μL，SYBR 5 μL，cDNA 4 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后對熔解曲線和擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，獲得Ct值，并采用2-ΔΔCt法對LINC01232的表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng) 使用McCoy5A′培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，80 U/mL青霉素，0.08 mg/mL鏈霉素)，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)大腸癌細(xì)胞系HCT-1116和HT-29，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的大腸癌細(xì)胞系HCT-116和HT-29接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)置NC組(轉(zhuǎn)染negative control)和si-LINC01232組(轉(zhuǎn)染LINC01232 Smarter Silence)，每組取2個(gè)Ep管，每管加入125 μL Opti-MEM培養(yǎng)液，其中1管加入5 μL Lipofectamine RNAiMAX，室溫溫育5 min，另1管加入濃度為20 μmol/L,體積為2.5 μL negative control或LINC01232 Smarter Silence，后將2管液體混合，室溫溫育20 min，于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染12 h后，收集細(xì)胞并采用RT-qPCR檢測NC組和si-LINC01232組LINC01232的表達(dá)水平，評估其轉(zhuǎn)染效率。LINC01232 Smarter Silence的靶序列：(1)GCCTGCTCCTACATCCCACA；(2)CTGCAGTAACGCAGCCACTA；(3)TGCGGGCCACCACTTCATTT；(4)CCCACATTTACCACTATCA；(5)CAAGAGTGCTGGATCTAAA；(6)GACACGTCATCTAGAATAA。

1.3.5CCK-8試驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h后的上述細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔約3×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，在0、24、48、72、96 h時(shí)，棄去上清液，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，采用SpectraMax i3x酶聯(lián)儀檢測450 nm處的吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6細(xì)胞克隆形成試驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞并制備成單細(xì)胞懸液，將1×103個(gè)細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1周，形成肉眼可見克隆細(xì)胞群落后，終止培養(yǎng)，用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫下固定30 min，1 g/L結(jié)晶紫染液染色30 min，將對照組克隆形成率設(shè)置為100%，實(shí)驗(yàn)組克隆形成率=(實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))×100%。

1.3.7Transwell試驗(yàn) 取上述轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，300×g離心5 min，收集細(xì)胞。將600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于Transwell小室中，將200 μL含有1×105個(gè)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基加至小室中，在37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)4%多聚甲醛室溫下固定40 min，1 g/L結(jié)晶紫染液染色30 min，流水清洗后置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察分析，隨機(jī)選擇3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.8western blot 將上述6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌3次后，300×g離心5 min，收集細(xì)胞，每孔加入100 μL RIPA裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，加入Loading buffer煮沸5 min，取40 μg總蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳(70 V 30 min，110 V 90 min)，使用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h，將PVDF膜分別與TM9SF2兔多克隆抗體(1∶1 000稀釋)及GAPDH兔單克隆抗體(1∶2 500稀釋)4 ℃溫育過夜，使用熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000稀釋)室溫溫育1 h,采用雙色紅外成像系統(tǒng)避光掃描拍照，并記錄蛋白質(zhì)條帶灰度值,以目標(biāo)蛋白灰度值/對應(yīng)內(nèi)參灰度值作為該組的目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量，再將對照組設(shè)置為1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，則實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)表達(dá)量=(實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)相對表達(dá)量/對照組蛋白質(zhì)相對表達(dá)量)。

2 結(jié)果

2.1基因芯片分析結(jié)果 通過基因芯片分析，共獲得23個(gè)差異表達(dá)的SE-LncRNA(Fold Change>2,P<0.05)，其中15個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào)。見表1。LINC01232在癌組織中顯著高表達(dá)(Fold Change=2.656 9,P=0.025 8)，故而本研究選擇LINC01232進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其超級增強(qiáng)子分布為chr13:100136209:100160564。

表1 大腸癌中差異表達(dá)的SE-LncRNA

2.2LINC01232在大腸癌組織中的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，在31對大腸癌組織中LINC01232的表達(dá)水平(2.015±2.865)明顯高于癌旁組織(1.000±2.036)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.388,P=0.023)。

2.3LINC01232表達(dá)與大腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以LINC01232在31對大腸癌組織表達(dá)量的中位數(shù)(1.481)為界值，將患者分為“高表達(dá)”和“低表達(dá)”組，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，LINC01232與TNM臨床分期(χ2=5.427，P=0.020)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=4.663，P=0.031)有關(guān)，而與年齡、性別、淋巴轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 大腸癌組織中LINC01232的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4ROC曲線分析 結(jié)果顯示，LINC01232篩查大腸癌的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.680(95%CI:0.544～0.807，P<0.05)，當(dāng)cut-off值為0.001 4時(shí)，敏感性和特異性分別為53.13%、78.13%。見圖1。

圖1 LINC01232的ROC曲線分析

2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果 RT-qPCR結(jié)果顯示，在HCT-116細(xì)胞中，si-LINC01232組的LINC01232的表達(dá)水平(0.488±0.034)較NC組(1.000±0.250)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.513，P=0.025)；在HT-29細(xì)胞中，si-LINC01232組的LINC01232的表達(dá)水平(0.510±0.064)較NC組(1.000±0.150)亦明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.176，P=0.034)。

2.6下調(diào)LINC01232對大腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成率的影響 CCK-8試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，在HCT-116中，si-LINC01232細(xì)胞組在72 h的增殖能力顯著低于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.197±0.015 vs 1.407±0.051,t=6.793,P=0.002)；在HT-29細(xì)胞中，si-LINC01232細(xì)胞組在72 h的增殖能力亦顯著低于NC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.891±0.066 vs 1.162±0.051,t=5.671,P=0.005)。見圖2A、2B。細(xì)胞克隆結(jié)果顯示，在HCT-116細(xì)胞中，si-LINC01232組的細(xì)胞克隆形成率較NC組顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(59.000±3.610)% vs(100.000±5.210)%,t=11.520,P<0.001]；在HT-29細(xì)胞中，si-LINC01232組的細(xì)胞克隆形成率亦較NC組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(52.000±3.210)% vs(100.000±8.801)%，t=9.731,P<0.001]。見圖2C、2D。

注：A、B，CCK-8試驗(yàn)檢測下調(diào)LINC01232對細(xì)胞增殖的影響；C、D，細(xì)胞克隆試驗(yàn)檢測下調(diào)LINC01232對細(xì)胞克隆形成率的影響；*，P<0.05。

2.7下調(diào)LINC01232對大腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響 遷移試驗(yàn)結(jié)果顯示,在HCT-116細(xì)胞中，與NC組比較，si-LINC01232組遷移的細(xì)胞數(shù)量顯著降低[(220.000±19.294)個(gè)vs(110.000±9.591)個(gè),t=8.521,P<0.001)，在HT-29細(xì)胞中，si-LINC01232組遷移的細(xì)胞數(shù)量亦顯著降低[(117.000±9.592)個(gè)vs(79.000±3.610)個(gè),t=8.310,P=0.001]；侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示, 在HCT-116細(xì)胞中，與NC組比較，si-LINC01232組侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著降低[(283.000±16.166)個(gè)vs(173.000±12.858)個(gè),t=7.736,P=0.002]，在HT-29細(xì)胞中，si-LINC01232組侵襲的細(xì)胞數(shù)量亦顯著降低[(123.000±6.429)個(gè)vs (47.000±3.511)個(gè),t=14.310,P<0.001]。見圖3。

圖3 LINC01232對細(xì)胞侵襲和遷移的影響(×100)

2.8LINC01232通過調(diào)節(jié)TM9SF2的表達(dá)水平促進(jìn)大腸癌的發(fā)生 通過對UCSC網(wǎng)站分析，顯示TM9SF2為LINC01232的臨近基因。TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明，在大腸癌組織中，TM9SF2與LINC01232的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.38,P<0.01)。RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了TM9SF2與LINC01232在31對大腸癌組織的表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.51,P<0.01)。在大腸癌細(xì)胞中，RT-qPCR結(jié)果表明，TM9SF2mRNA水平在LINC01232 下調(diào)后降低，在HCT-116中結(jié)果為(1.000±0.250 vs 0.557±0.090,t=2.889,P=0.044)，在HT-29中結(jié)果為(1.000±0.170 vs 0.643±0.040,t=3.028,P=0.039)。見圖4A。western blot結(jié)果顯示，TM9SF2蛋白水平亦在LINC01232下調(diào)后降低，在HCT-116中結(jié)果為(1.000±0.050 vs 0.560±0.040,t=11.900,P<0.001)，在HT-29中結(jié)果為(1.000±0.150 vs 0.433±0.065,t=6.003,P=0.004)。見圖4B。

注：A，RT-qPCR檢測下調(diào)LINC01232對TM9SF2 mRNA表達(dá)水平的影響；B，western blot檢測下調(diào)LINC01232對TM9SF2蛋白表達(dá)水平的影響;*，P<0.05。

3 討論

SE-LncRNA由超級增強(qiáng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來，且與多種疾病，尤其與癌癥密切相關(guān)。許多惡性腫瘤都伴隨著SE-LncRNA表達(dá)水平的顯著變化[10-11]。本研究采用基因芯片技術(shù)在大腸癌中篩選出了異常高表達(dá)的LINC01232。為驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，本研究繼續(xù)收集31對大腸癌組織并檢測LINC01232的表達(dá)水平，證實(shí)了LINC01232在大腸癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。本研究進(jìn)一步分析了LINC01232表達(dá)與大腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC01232與TNM臨床分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在顯著的正相關(guān)性，表明LINC01232可作為大腸癌是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物。由于本研究收集的是2017年10月至2019年12月期間首次入院患者的組織標(biāo)本，預(yù)后及療效觀察期較短，LINC01232的預(yù)后相關(guān)性分析有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。有文獻(xiàn)報(bào)道SE-LncRNA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為來影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在本研究中，下調(diào)LINC01232抑制大腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，說明LINC01232是通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為調(diào)節(jié)大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

研究表明，LINC01232可通過競爭性結(jié)合microRNA-654-3p，促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展[7]；在胰腺癌中，LINC01232通過抑制泛素介導(dǎo)的HNRNPA2B1降解,從而激活A(yù)-Raf誘導(dǎo)的MAPK/ERK信號通路，促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移[12]。但LINC01232在大腸癌中的作用機(jī)制仍沒有被學(xué)者研究過。通過順式作用調(diào)控臨近基因的表達(dá)是SE-LncRNA發(fā)揮功能的重要機(jī)制之一[13]。UCSC網(wǎng)站分析顯示TM9SF2為LINC01232的臨近基因，且TM9SF2已經(jīng)被證實(shí)可通過調(diào)節(jié)CCNA2、CCNB2和AURKA等癌基因的表達(dá)促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，在大腸癌中起促癌作用[14]。為了證實(shí)LINC01232是否通過調(diào)控臨近基因TM9SF2的表達(dá)以促進(jìn)大腸癌的發(fā)展，本研究首先通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析得出TM9SF2與LINC01232在組織中的表達(dá)呈正相關(guān)，其次，RT-qPCR進(jìn)一步在31對大腸癌組織中證實(shí)了這一結(jié)果。同樣地，在大腸癌細(xì)胞系HCT-116和HT-29中，TM9SF2mRNA和蛋白質(zhì)水平在LINC01232下調(diào)后降低。以上結(jié)果與Li等[8]在胰腺癌研究機(jī)制結(jié)果一致，表明LINC01232可以通過調(diào)節(jié)TM9SF2的表達(dá)促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LINC01232在大腸癌組織的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，且與臨床TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。LINC01232對大腸癌診斷的敏感性為53.13%，特異性為78.13%。在HCT-116和HT-29細(xì)胞中，下調(diào)LINC01232可以抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。LINC01232可能通過直接調(diào)節(jié)臨近癌基因TM9SF2的表達(dá)以促進(jìn)大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。因此，有關(guān)LINC01232調(diào)節(jié)TM9SF2的具體機(jī)制、大腸癌患者血清中的表達(dá)水平驗(yàn)證值得進(jìn)一步深入探討。