雷帕霉素促進上頜竇黏膜細胞成骨分化

林彥君 王榮昌 許江漢 劉超瑋 陳江 吳東

上頜后牙缺失導致的該區(qū)域牙種植手術中骨量不足或骨缺損在臨床較為常見，目前對于此類患者的牙種植治療方式一般是進行上頜竇提升手術并種植[1]。經牙槽嵴上頜竇底提升術是一項具有良好遠期成功率的上頜竇提升術術式[2]。而且，很多臨床醫(yī)生在經牙槽嵴上頜竇底提升術過程中不植入骨替代材料。然而，臨床上可觀察到不植骨同樣可獲得較好的骨增量，滿足了種植手術對骨量的要求[3]。目前的研究表明，不植骨下行上頜竇提升術獲得的充足的骨量和上頜竇的成骨潛能有關。上頜竇具有成骨潛能的原因之一是上頜竇黏膜內含有間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，即上頜竇黏膜細胞(maxillary sinus membrane cells，MSMCs)[4]。MSMCs已經被證實具有良好的成骨能力，是一種優(yōu)秀的組織工程種子細胞[5]。MSMCs作為一種間充質干細胞，具有間充質干細胞的生物學特性。牙齦間充質干細胞作為口腔內常見的間充質干細胞類型，其成骨分化已被證實受自噬影響[6]。而雷帕霉素(rapamycin，RAPA)是經典的mTOR抑制劑，可激活細胞自噬[7]。因此，RAPA對MSMCs成骨分化是否存在影響以及是否通過自噬途徑產生影響值得進行探討研究。

本研究擬行體外分離培養(yǎng)SD大鼠MSMCs，RAPA誘導建立細胞自噬模型并使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)驗證；檢測RAPA處理后成骨誘導過程的3 個時間點的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)表達，鈣沉積物數(shù)量，成骨相關基因Runx2、和Spp1以及自噬相關基因Anxa3和Becn1的變化，探究RAPA對MSMCs的成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

透射電子顯微鏡(Tecnai G2 F20 S-TWIN，F(xiàn)EI，美國)； 濾光片型酶標儀(BIO-RAD iMark，Bio-Rad，美國)； 梯度PCR擴增儀[LifeECO TC-96/G/H(b)C，Bioer，杭州博日科技股份有限公司]； 紫外分光光度計(Q5000，Quawell，美國)； 實時熒光定量PCR儀(LightCycler 480，Roche，美國)；雷帕霉素(MCE，美國)；地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)；α-MEM(Hyclone，美國)；ALP檢測試劑盒(Beyotime，上海碧云天生物技術有限公司)；茜素紅S染色液(1%，pH4.2)(BioBomei，合肥博美生物科技有限責任公司)；Trizol Reagent(Invitrogen，美國)；PrimeScript?反轉錄試劑盒、SYBR?PCR試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.2 MSMCs的分離培養(yǎng)

將SD大鼠上頜竇黏膜組織在培養(yǎng)液浸潤下剪碎，3 g/L I型膠原酶和4 g/L dispase酶等比混合，37 ℃水浴消化1h，離心棄上清，沉淀用培養(yǎng)液充分混勻，反復吹打離散細胞團塊，70 μm細胞篩網過濾獲得單細胞懸液，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，置入3.5 cm培養(yǎng)皿內37 ℃恒溫培養(yǎng)箱標準條件下培養(yǎng)。細胞生長融合70%后傳代，取第3 代細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 RAPA處理MSMCs后成骨誘導分化

不同濃度的RAPA預處理MSMCs，濃度為0、10、100、1 000 nmol/L，時間為4 h。之后換用成骨細胞誘導分化培養(yǎng)液(10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、0.2 mmol/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，7、14、21 d后檢測ALP活性、鈣結節(jié)形成量以及自噬和成骨基因的表達量。

1.4 MSMCs自噬水平鑒定

MSMCs用細胞刮刮下，電鏡固定液4 ℃固定2 h。鋨酸0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)室溫固定2 h。酒精梯度脫水。丙酮和812包埋劑等比混合液滲透過夜，純812包埋劑滲透過夜，60 ℃聚合48 h。 70 nmol/L超薄切片鈾鉛雙染色，室溫干燥過夜。TEM下觀察拍照。

1.5 ALP活性檢測

用RIPA裂解MSMCs，BCA試劑盒測定各組細胞總蛋白濃度，ALP試劑盒檢測ALP活性(pNPP法)，實驗步驟參照廠家說明書。

1.6 茜素紅染色

4%多聚甲醛固定MSMCs，20 min后去離子水洗凈，加40 mmol/L茜素紅(pH=4.2)，37 ℃反應30 min。去離子水洗至不再脫色，鏡下觀察并拍照。

1.7 實時熒光定量PCR

Trizol提取MSMCs總RNA，紫外光譜法鑒定RNA純度和濃度。使用Prime Script?RT試劑盒，gDNA Eraser去除基因組DNA，加反轉錄體系，反應條件為37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育15 s，4 ℃孵育10 min，反轉錄合成cDNA。使用SYBR?PCR試劑盒，以反轉錄產物為模板，用上下游引物PCR擴增目的片段，在實時熒光定量PCR儀內擴增。反應條件為95 ℃預變性30 s，然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，擴增 40 個周期。Gapdh作為內參。用2-ΔΔCt法計算相關基因的相對表達量。鉑尚生物技術(上海)有限公司合成引物序列(表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計分析

2 結 果

2.1 MSMCs自噬水平鑒定

MSMCs經不同濃度RAPA處理4 h后胞質內可見自噬溶酶體形成。 0 nmol/L處理水平的MSMCs自身具有一定水平的自噬。RAPA濃度增加，自噬溶酶體數(shù)量隨之增加。自噬溶酶體呈雙層膜結構，根據(jù)其內殘余細胞器形態(tài)可判斷內容物主要來自粗面內質網(圖1)。RAPA處理后自噬囊泡數(shù)量有明顯提高并呈劑量依賴性，說明RAPA可有效激動自噬。

2.2 ALP活性檢測結果

圖1 RAPA處理MSMCs 后TEM鏡下觀(→： 自噬溶酶體)(×8 000)

成骨誘導后7、14、21 d，和對照組(0 nmol/L RAPA處理組)相比，10 nmol/L RAPA處理組、100 nmol/L RAPA處理組、1 000 nmol/L RAPA處理組的ALP表達均有明顯差異性(P<0.05)(圖2)。

2.3 茜素紅染色結果

隨著成骨誘導時間的推移，鈣結節(jié)的數(shù)量逐漸增加。成骨誘導后7 d，不同濃度RAPA處理的MSMCs茜素紅染色后未見明顯著色物質。成骨誘導后14 d和21 d，100 nmol/L RAPA處理組的MSMCs的鈣結節(jié)物高于其他組別(圖3)。

2.4 自噬和成骨基因轉錄水平檢測結果

圖2 RAPA處理MSMCs后ALP活性檢測

圖3 RAPA處理MSMCs后茜素紅染色

成骨誘導后7、14、21 d 三個時間點中，只有7 d時，100 nmol/L和1 000 nmol/L RAPA處理組的Anxa3基因表達與對照組(0 nmol/L RAPA處理組)相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)； 7、14、21 d時，1 000 nmol/L RAPA處理組的Becn1基因表達與對照組相比，具有統(tǒng)計學差異； 7 d和14 d時，100 nmol/L RAPA處理組的Runx2和Spp1基因表達與對照組相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。Anxa3、Becn1、Runx2和Spp1的相對表達量都隨著成骨誘導周期延長而減少(圖4)。

3 討 論

上頜竇提升術后的成骨細胞來源歷來頗有爭議。一部分研究認為，上頜竇提升術后的成骨細胞來源為骨組織來源，比如從牙槽骨和上頜竇骨壁遷移至骨面的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)[8]。而上頜竇黏膜在愈合的早期階段對種植體頂端骨形成不起作用[9]。但上頜竇黏膜作為上頜竇內不可缺少的解剖結構[10]，新生骨在血凝塊機化區(qū)域經常與上頜竇黏膜接觸，提示該膜在愈合中后期具有骨誘導潛能。從上頜竇黏膜中分離獲得的MSMCs的生物學特性也進一步明確了上頜竇黏膜是上頜竇提升術后的成骨細胞來源之一[4]。雖然上頜竇黏膜的成骨作用弱于周圍的上頜竇骨壁[11]，但MSMCs具有不弱于BMMSCs的增殖和成骨能力[12]。MSMCs在成骨分化過程中可有效表達成骨標志基因ALP、BSP、OCN和ON[13]。

MSMCs的成骨分化調節(jié)因素十分復雜。RAPA作為外源性藥物分子，結合分子靶位點mTOR，激活下游自噬相關分子信號[14]。自噬是MSCs分化過程中與細胞結構重塑相關的重要途徑[15]。在細胞分化過程中，自噬途徑的改變可影響與形態(tài)功能變化相關的需求[16]。例如，自噬可調節(jié)白藜蘆醇和成骨誘導因子對MSCs成骨細胞分化的協(xié)同誘導[6]。但較高的自噬活性會導致MSCs成骨分化潛能降低。將自噬激動劑RAPA或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3- methyladenine，3-MA)預處理的MSCs植入裸鼠皮下，結果顯示，RAPA處理組異位骨樣組織形成增多，而3-MA處理組成骨能力的恢復受抑制[17]。這提示合適水平的自噬促進了MSCs的成骨分化。本研究基本探明了RAPA對MSMCs成骨分化的影響，主要體現(xiàn)在合適濃度的RAPA促進了ALP蛋白、Runx2基因和Spp1基因的表達。而過高濃度的RAPA本身容易引起細胞毒性反應以及自噬內穩(wěn)態(tài)失衡致使細胞凋亡。Anxa3和Becn1作為自噬發(fā)生的關鍵標志物，參與了經典的AMPK通路和MAPK通路。本研究發(fā)現(xiàn)MSMCs的Anxa3和Becn1的改變和成骨標志基因具有同步性，提示RAPA對MSMCs成骨分化的調節(jié)可能是通過AMPK通路和MAPK通路發(fā)揮作用。

綜上，本研究結果表明適當濃度的RAPA可促進MSMCs成骨分化，這一過程可能與自噬相關。但RAPA促進MSMCs成骨分化的具體機制尚未闡明，需進一步研究。同時，以上結果也提示骨替代材料或鈦表面加載RAPA對上頜竇提升術預后的原位骨量再生可能有促進作用。