ALPL在BMMSCs調(diào)控血管內(nèi)皮細胞管腔形成中的作用研究

董加一 趙疆東 陳驥 劉文佳 李德華

低堿性磷酸酯酶癥(hypophosphatasia,HPP)，是一種由ALPL基因突變導致機體骨骼和牙齒發(fā)育不全的遺傳性疾病，HPP發(fā)病率較高，約為十萬分之一，其臨床表現(xiàn)主要為骨量大量喪失，骨小梁密度下降且排列紊亂，重者出現(xiàn)軟骨病或佝僂病等。研究報道，ALPL基因突變造成編碼TNSALP功能缺失，促使骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)成脂分化明顯增加，成骨分化顯著降低[1-2]，這與HPP的相關(guān)病理性骨發(fā)育異常密切相關(guān)。

大量研究證實在在骨缺損愈合中，BMMSCs可誘導血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成從而促進骨內(nèi)血管新生[3-5]。骨作為一種高度血管化的組織，血管新生和內(nèi)皮細胞來源的信號分子在調(diào)控骨重建與再生過程中同樣發(fā)揮重要作用[6]。最近在人和鼠科動物長骨干骺端與骨膜下發(fā)現(xiàn)一種特殊的毛細血管，其高表達CD31和EMCN，命名為H型微血管(CD31hiEMCNhi)[7-9]。已有研究證實骨質(zhì)疏松小鼠模型和骨質(zhì)疏松及骨量欠佳病人H型血管數(shù)量明顯減少[10-12]。以上說明，這種特殊的H型血管在調(diào)節(jié)骨發(fā)育、維持骨骼動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，且與骨相關(guān)疾病密切相關(guān)。但ALPL基因突變是否會影響B(tài)MMSCs對內(nèi)皮細胞的誘導目前尚未有研究報道，本實驗深入探究BMMSCs中ALPL基因?qū)?nèi)皮細胞管腔形成的影響，旨在進一步探索ALPL基因功能，期待找到一種推動硬組織內(nèi)血管新生的方法以解決HPP患者骨缺損問題。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

α- MEM、谷氨酰胺(Gibco，美國)；ECM培養(yǎng)基(ScienCell, 美國)； 胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)； 100 U/mL青霉素、鏈霉素(Invitrogen, Cadsbad, 美國)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,日本)；酶標儀(BIO-TEC,美國)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo, 美國)；YJ-875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；冰凍切片機(Leica, 德國)；激光共聚焦顯微鏡(Nikon,日本)；ALP染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega, 美國)；ALPL(abcam, 美國)、CD31(R&D SYSTEMS, 美國)、EMCN(Santa Cruz Biotechnology，美國)、GAPDH(上海翊圣生物科技有限公司)、二抗(Jacson, 美國)、Hoechst(Med ChemExpress, 美國)； Matrigel膠、24 孔transwell(Corning, 美國)； ALPL基因敲除(ALPL+/-)小鼠(Jackson, 美國)。

1.2 細胞的分離和培養(yǎng)

1.2.1 細胞培養(yǎng) 內(nèi)皮細胞ECs和人骨髓間充質(zhì)干細胞(第四軍醫(yī)大學組織工程中心提供)，分別在含10%血清、青霉素和鏈霉素的ECM培養(yǎng)基和α- MEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，換液2 d/次，當細胞達到70%～80%后用0.25%胰酶消化，以1 ∶3比例傳代。

1.2.2 BMMSCs的分離和培養(yǎng) 取5 周齡雌性C57BL/6小鼠2 只，脫頸處死后用75%的乙醇浸泡5 min，無菌條件下分別剝離小鼠的股骨、脛骨，減去干骺端后，用注射器吸取含20%血清的α- MEM反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液于離心管中進行吹打后，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中。72 h后首次換液，以后換液2 d/次，當貼壁細胞達到90%后用0.25%胰酶消化，按1 ∶2比例傳代。

1.3 病毒的包裝

分別取包裝質(zhì)粒PSPAX、PMD2G及目的質(zhì)粒Sh-ALPL(第四軍醫(yī)大學組中工程中心提供)，并按照磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染6 h后換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收取病毒液。

1.4 ALPL基因調(diào)控骨內(nèi)血管形成

1.4.1 hBMMSCs的慢病毒轉(zhuǎn)染及鑒定 取生長良好的第三代h-BMMSCs，以1×105/mL的密度接種于6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至細胞達到80%時，將細胞隨機分為2 組(對照組，Sh-ALPL)。Sh-ALPL組加入1 mL已提取的病毒液，轉(zhuǎn)染8 h后換為完全培養(yǎng)基。處理72 h后，分別提取兩組細胞蛋白，Western-Blot法檢測兩組細胞中ALPL蛋白表達水平。然后再分別將兩組細胞經(jīng)PBS清洗后用4%多聚甲醛固定20 min，加入適量BCIP/NBT染色工作液，室溫下避光孵育30 min，去除染色液并終止染色反應后，觀察并拍照。

1.4.2 免疫熒光檢測骨內(nèi)H型血管數(shù)量變化 從ALPL+/-小鼠和野生型(WT)小鼠股骨取材，用4%的多聚甲醛于4 ℃冰箱內(nèi)固定6 h，PBS清洗3 次后在4 ℃冰箱中靜置脫鈣72 h。脫鈣完成后30%蔗糖脫水，OCT包埋后切片，每張切片的厚度為30 μm。 PBS徹底清洗包埋劑后山羊血清封閉30 min，再一抗以1 ∶100稀釋后，4 ℃孵育過夜，次日以1 ∶200稀釋熒光二抗，避光室溫孵育75 min后PBS清洗3 遍，Hoechst染核15 min后甘油封片，免疫熒光顯微鏡觀察H型血管數(shù)量。

1.4.3 管腔形成實驗 采用24 孔的共培養(yǎng)模型，分別接種健康和HPP患者BMMSCs(Nor-hBMMSCs和HPP-hBMMSCs)、WT-mBMMSCs、ALPL+/-mBMMSCs于上室中，下層每孔鋪200 μL Matrigel膠，37 ℃孵育30 min后，將ECs以1×105的密度接種于基質(zhì)膠上培養(yǎng)3 h后在倒置顯微鏡下觀察ECs管腔形成情況并拍照。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較用One-way ANOVA，檢驗水準α=0.05。 *為P<0.05, *為P<0.01, *為P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 細胞的培養(yǎng)和形態(tài)學觀察

h-BMMSCs(第四軍醫(yī)大學組織工程中心提供)培養(yǎng)并傳至第三代，細胞增殖迅速，呈長梭形，大部分區(qū)域形成細胞團簇，并且相互融合，呈旋渦狀盤旋排列(圖1)。原代培養(yǎng)m-BMMSCs 3d，倒置顯微鏡下細胞胞體明顯增大并開始分裂，細胞呈成纖維細胞樣生長(圖1)。ECs第5代細胞(第四軍醫(yī)大學組織工程中心提供)，細胞增殖迅速，呈扁平多角形或梭型，細胞間相互連接，邊界清楚，胞漿豐富(圖1)。

圖1 細胞的形態(tài)學觀察(×100)

2.2 轉(zhuǎn)染效率的鑒定結(jié)果

慢病毒浸染法下調(diào)hBMMSCs中ALPL 表達，48 h后Western-Blot檢測結(jié)果顯示，下調(diào)組ALPL表達水平顯著低于對照組(圖2)；另外ALP染色結(jié)果顯示，相較于對照組Sh-ALPL組的染色結(jié)果明顯減弱(圖2)。以上結(jié)果證實，通過慢病毒浸染可有效調(diào)控h-BMMSCs中ALPL表達。

2.3 ALPL 在hBMMSCs中調(diào)控ECs管腔形成

圖2 ALPL轉(zhuǎn)染效率鑒定結(jié)果

首先將Nor-hBMMSCs 和HPP-hBMMSCs與ECs共培養(yǎng)3 h，發(fā)現(xiàn)與ECs組相比，兩者均可促進ECs的管腔形成能力，但是HPP組效果明顯低于Nor組，尤其體現(xiàn)在管腔分支數(shù)和分支長度方面(圖3)。隨后，我們將WT-mBMMSCs 和ALPL+/-mBMMSCs與ECs共培養(yǎng)，同樣發(fā)現(xiàn)ALPL敲除組促進ECs管腔形成能力較WT組顯著下降(圖4)。

圖3 Nor-hBMMSCs、HPP-hBMMSCs調(diào)控ECs成管腔能力比較(×100，n=3)

為進一步證實該現(xiàn)象，在Nor-hBMMSCs中下調(diào)ALPL表達，觀察其對ECs管腔形成的影響，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ALPL組的ECs成管腔能力較Nor組明顯下降，且各組均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖5)。以上結(jié)果均表明ALPL基因在BMMSCs調(diào)控血管內(nèi)皮細胞管腔形成中發(fā)揮重要作用。

最后，在ALPL敲除小鼠中進一步觀察ALPL對骨內(nèi)H型血管的影響。體內(nèi)免疫熒光染色結(jié)果顯示H型血管標記物CD31和EMCN分子在野生型小鼠股骨干骺端生長板附近高表達，相反在ALPL+/-小鼠中CD31hiEMCNhi的表達量要明顯低于野生型小鼠，提示ALPL參與調(diào)控骨內(nèi)H型血管化程度(圖6)。

圖4 WT-mBMMSCs、ALPL+/- mBMMSCs調(diào)控ECs成管腔能力比較(×100，n=3)

圖5 Nor-hBMMSCs、Sh-ALPL hBMMSCs調(diào)控ECs成管腔能力比較(×100，n=3)

圖6 WT與ALPL+/-小鼠股骨H型血管的變化比較(免疫熒光染色, ×100)

3 討 論

HPP是一種以骨骼和牙齒等硬組織礦化不良為特征的單基因遺傳性疾病，典型的癥狀表現(xiàn)為病理性骨折，骨早衰及骨質(zhì)疏松等。骨科X線檢查可見骨小梁大量喪失且排列紊亂，其病理變化的主要原因在于由ALPL編碼的TNSALP功能異常，導致其未能形成高度難溶的羥基磷灰石(HA)結(jié)晶，最終無法實現(xiàn)牙、骨等硬組織礦化與再礦化[13-14]。另外已有體外研究顯示，ALPL基因缺陷造成骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)分化異常[1-2]，提示TNSALP蛋白不只在生物礦化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還可以影響B(tài)MMSCs生物學行為，造成骨骼生長發(fā)育異常。

骨持續(xù)性改建的動態(tài)過程中，血管新生作為骨愈合的先決條件為骨組織提供必要營養(yǎng)、氧氣、生長因子和激素[15-16]，在此過程中BMMSCs參與骨形成和內(nèi)皮細胞(ECs)參與的血管化之間相互耦聯(lián)以實現(xiàn)骨修復再生。最新研究顯示，生理環(huán)境中，H型血管通過產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-α)、血小板衍生生長因子(PDGF-BB)、低氧誘導轉(zhuǎn)錄因子(HIF-1α)等積極地指導骨內(nèi)血管和骨形成[7,17-18]。

HPP疾病微環(huán)境下，骨質(zhì)量下降是否誘發(fā)骨內(nèi)H型血管發(fā)生改性值得進行探討。本文發(fā)現(xiàn)ALPL基因缺陷影響HPP患者和ALPL敲除小鼠BMMSCs對血管內(nèi)皮細胞管腔形成的調(diào)控作用。另外本研究發(fā)現(xiàn)ALPL敲除小鼠中骨內(nèi) H型血管的數(shù)量減少。我們實驗結(jié)果揭示ALPL可能在骨髓間充質(zhì)干細胞調(diào)控骨內(nèi)血管新生方面具有潛在作用，進一步為認識HPP病理性骨缺損提供新的方向。盡管本研究證實ALPL在調(diào)控內(nèi)皮細胞管腔形成中發(fā)揮作用，但是其潛在的作用方式尚需在后續(xù)工作中進行探討。